Construcción de una proteína quimérica beta catenina-EGFP

DE BOECK MAXIMILIANO; VALDECANTOS, PA

Tucumán

Jornada; XXI Jornadas Científicas y Encuentro de Jóvenes Investigadores ?Augusto Palavecino; 2020

Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia - UNT

Introducción: β-catenina es una proteína de 92 kDa, codificada por el gen CTNNB1. Esta proteína de 781 aminoácidos consta de tres dominios: amino-terminal, carboxilo-terminal y central. β-catenina es un componente principal de las uniones adherentes en las células epiteliales, adicionalmente regula la expresión génica a través de la vía de señalización WNT/β-catenina. La coordinación de estas dos funciones es fundamental para homeostasis epitelial.Objetivos: Realizar una investigación bibliográfica de diferentes métodos de clonación basados en la recombinación, en los que no se utilizan enzimas de restricción; aplicar los conocimientos adquiridos para la elaboración de protocolos que puedan ser incorporados al laboratorio de biología molecular para la construcción genética de una proteína quimérica β-catenina de Bos taurus fusionada a la proteína fluorescente verde EGFP.Materiales y métodos: A partir de la secuencia de ARN-mensajero (ARNm), obtenida de la base de datos National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov), se diseñaron pares de cebadores específicos con sus respectivas modificaciones para β-catenina y el vector pEGFP-C2 para su amplificación y posterior clonación in sílico del ADN complementario de β-catenina de Bos taurus en el vector pEGFP-C2, siguiendo (a) el método convencional de clonado y (b) el de clonado in vivo y (c) el método de Gibson (Gibson Assembly).Resultados: Con el par de cebadores diseñados para clonado convencional, se amplificó mediante RT-PCR un producto de 2.363 pb que luego fue digerido, al igual que el plásmido pEGFP-C2, con la enzima de restricción NheI. Por otro lado, los cebadores diseñados para clonado in vivo se utilizaron para el clonado in sílico de β-catenina en pEGFP-C2, obteniendo un producto de 7.116 pb; además, en el clonado in sílico con el método de Gibson, se obtuvo un producto de 7.081 pb que contiene la construcción quimérica β-catenina-EGFP.Conclusiones: El clonado in vivo es una estrategia muy conveniente y ventajosa con respecto a las técnicas de clonado convencional y de Gibson. La proteína quimérica construida será una buena herramienta para el estudio de su localización celular y los mecanismos de señalización en los que participa β-catenina en cultivos in vitro de células epiteliales del oviducto bovino.