PIP2: una molecula clave en el desarrollo de la metástasis intraperitoneal de cáncer de ovario

MARIBEL NICOLA; PATRICIA KUNDA

Cordoba

Otro; Informe final de beca-RENIS; 2018

Introducción.El cáncer de ovario epitelial (COE) es una enfermedad maligna difícil de curar debido a que es asintomática, altamente proliferativa, metastásica, complicada de extraer con cirugía, y hasta se torna quimiorresistente, experimentando recurrencia. En Argentina, es el quinto respecto a otros tipos de cáncer, con una incidencia de 3,8% (IARC 2012). Este carcinoma se origina de las células que cubren el ovario, sin embargo, pueden desprenderse y diseminarse por la cavidad del peritoneo. Allí, logran sobrevivir como células simples o agregadas (esferoides) que flotan en el fluido ascítico o se adhieren al peritoneo, afectando órganos vitales. En el proceso metastásico, interviene la mecánica y dinámica de la corteza celular y el citoesqueleto. La corteza celular formada por actina, está ubicada debajo de la membrana plasmática junto a diferentes proteínas de unión. Entre ellas, la familia de proteínas ERM (ezrina, radixina, moesina) son las encargadas de enlazar los filamentos de actina a la membrana plasmática, regulando morfología, migración y adhesión celular. Las ERM son tres proteínas homólogas, miembros de la superfamilia de la banda 4.1. Suestructura posee tres dominios, uno altamente conservado, FERM en el N-terminal, una región central alfa helicoidal y uno en el C-terminal. Según su conformación, adoptan dos estados fisiológicos. La forma autoinhibida reside en el citosol en una forma cerrada, por la unión de FERM con C-terminal. La forma activa o abierta reside en la corteza celular y se abre o activa gracias a dos pasos claves: la unión al fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2) y la fosforilación del residuo treonina conservado del C- terminal. El PIP2, ubicado en la cara interna de la membrana plasmática, recluta las ERM desde el citosol, las estabiliza estructuralmente y permite su fosforilación y activación. En esta condición, el dominio FERM de la proteína se une a la membrana plasmática y el dominio C-terminal a la F-actina.Diversos estudios observaron elevada expresión de ezrina o moesina en cánceres metastásicos. Por lo que, se podría inferir que ezrina y moesina están implicadas en distintos aspectos de la metástasis del COE.En virtud de esto, PIP2 y las ERM podrían tener alto potencial como blancos de valor terapéutico, diagnóstico y pronóstico. Por lo tanto, conocer las características del mecanismo de activación de las ERM dependiente de PIP2, contribuiría a encontrar mecanismos claves del proceso metastásico y a estudiar factores que controlen el remodelado de actina para terapias en contra de la diseminación del COE. Por todo esto, en este proyecto se estudió la morfología celular y la expresión de las proteínas ERM en un modelo in vitro de COE en presencia de neomicina. Este antibiótico, un aminoglucósido con carga positiva es utilizado para secuestrar PIP2. Se cree que esto podría alterar la activación de las ERM, por lo tanto, modificaría la morfología de las células del COE dada su unión a actina. Para verificar la activación de ezrina y moesina, en función de su interacción con PIP2, se observó el efecto de la neomicina en el medio de cultivo de células SKOV3 y se estudió el rol de PIP2 en la activación de las proteínas ERM.Métodos.El tratamiento con neomicina (10 mM) (5) durante 10, 30 min, 1, 6 y 11 h fue realizado sobre una monocapa de células SKOV3, previamente crecidas durante 24 h (modelo in vitro de cáncer de ovario epitelial humano).Los controles fueron incubados en medio de cultivo sin antibióticos. Inmunofluorescencia y Western blotting (WB) fueron realizados para analizar cualitativa y cuantitativamente la actina, la alfa-tubulina y las proteínas ERM en estado fosforilado. Posteriormente, se realizó el análisis y cuantificación de las imágenes tomadas a través del programa Fiji.Resultados y Discusión.Los resultados obtenidos ratificaron la presencia de las proteínas ERM activadas por fosforilacion en la zona de la corteza celular. Esto concuerda con el mecanismo de activación de las ERM, las cuales, son reclutadas a la membrana celular por el PIP2 para su posterior fosforilación. En este estudio se corroboró que la neomicina sobre células SKOV3 provocó una disminución de la expresión de las ERM fosforiladas en la corteza celular, en comparación con las ERM de las células control. El tiempo al cual ocurrió la mayor disminución de la fosforilación de las ERM fue a los 30 min de tratamiento.El WB confirmó la disminución significativa de la fosforilación de las ERM a los 30 min, dado que ocurrió en un 40%, y a los 10 min en un 20% con respecto a las células control no tratadas. Sin embargo, los estudios realizados con tiempos de exposición más prolongados (1, 6 y 11 h) mostraron una recuperación del nivel de expresión de las fosfo-ERM. Sumado a esto, la actina de las células tratadas con neomicina adoptó una morfología redondeada respecto a la actina de las células control. En contraposición, los microtúbulos de las células tratadas no mostraron cambios significativos de morfología respecto a los microtúbulos de las células control.En conjunto, estos datos evidenciaron que la neomicina, por su acción secuestrante del PIP2, modificó los niveles de activación de las ERM, demostrando que PIP2 estaría interviniendo en el mecanismo de activación de las proteínas ERM en el COE. Previsiblemente, cuando las ERM se unen a membrana, la modelan y la célula experimenta cambios morfológicos. Estos cambios, podrían intervenir en el proceso de invasión y en consecuencia, en la metástasis del COE. En conclusión, estos hallazgos promoverían el estudio de la neomicina como agente retardante de la metástasis en COE para un posible tratamiento del COE.