Elaboración y evaluación de una prueba de aglutinación modificada para la detección de anticuerpos en la toxoplasmosis animal

RUNCO, M.; CAMPERO, L.M.; GOS, M.L.; PARDINI, L. ; VENTURINI, M.C.

La Plata

Congreso; XII Jornadas y Reunión Anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria; 2019

Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria

Toxoplasma gondii es un protozoo que afecta a una gran diversidad de especies animales, incluido el hombre. El diagnóstico de la enfermedad es importante para la salud pública y permite adoptar distintas medidas de control. Algunos kits comerciales disponibles en el mercado fueron desarrollados para el diagnóstico en humanos. En un estudio previo se utilizó una prueba de aglutinación comercial indicada para el diagnóstico en humanos, para la detección de anticuerpos en perros, demostrando baja sensibilidad y moderada especificidad (Gos, 2016). Esto demuestra la importancia de estandarizar y validar cualquier prueba diagnóstica previo a su uso en medicina veterinaria. La prueba de aglutinación modificada (MAT) ha sido utilizada con éxito para el diagnóstico de toxoplasmosis en especies domésticas y especialmente silvestres ya que no requiere conjugados específicos. Siguiendo la metodología propuesta por Dubey y Desmonts (1987) el objetivo del trabajo fue producir antígeno para la prueba de MAT y evaluarla en nuestro medio a partir de un estándar relativo de comparación (ERC) conformado según las normas de la OIE. Para ello, se formó un panel de 24 sueros provenientes de distintas especies animales (perros y cabras) y se evaluó mediante 2 pruebas diagnósticas de referencia, la Inmunofluorescencia indirecta (IFI) con un título de corte de 1:50 para perros y 1:100 para cabras y la prueba de Immunoblot (IB). Con IB un suero se considero positivo al detectarse reacciones hacia 2 o más antígenos inmunodominantes (34, 32, 30, 28 kDa). El antígeno se elaboró en el LAINPA infectando células VERO con la cepa RH de T. gondii. Luego de 48-72 hs. de crecimiento , se recolectaron los taquizoítos y se purificaron en columnas (PD-10 Desaltingcolumns, GE Healthcare, UppsalaSuecia). Se inactivaron con formalina y se conservaron a 4°C. Los sueros fueron seleccionados respetando la proporción sugerida de 1:3 (positivo:negativo) (OIE, 2005). Se diluyeron en buffer de dilución (pH 7,2) desde 1:25 hasta 1: 200. El antígeno se diluyó en una solución buffer alcalina (pH 8,95) adicionando 2-mercaptoetanol como agente reductor y azul de Evans como colorante. Se colocaron 25µl/pocillo de antígeno en una microplaca de 96 pocillos y se agregaron 25 µl de las diluciones de los sueros por pocillo. Se incubó la placa cubierta con film a 37ºC overnight seguido de 4 horas de incubación a 4°C. La lectura se realizó mediante el uso de un espejo magnificado. Se consideró un resultado positivo la visualización de un entramado y un resultado negativo a la observación de un botón azul en fondo del pocillo. Se evaluó el desempeño de la prueba de MAT respecto al ERC. Los resultados obtenidos para la detección de anticuerpos en los sueros analizados con la prueba de MAT coincidieron en su totalidad con los resultados obtenidos por IFI e IB, sin registrar resultados falsos positivos o falsos negativos.Si bien para estandarizar la prueba, es necesario un mayor número de sueros de animales de distintas especies, estos resultados preliminares sugieren que su uso permitiría la obtención de resultados confiables en relación con la sensibilidad y especificidad de la prueba. El uso de una prueba de diagnóstico tiene relación con el objetivo del estudio. Por esa razón, en el caso de realizar un seguimiento diagnóstico, sería más adecuado el uso de pruebas primarias (IFI, ELISA, IB). Sin embargo, la prueba de aglutinación modificada validada en diferentes especies, permitiría analizar muestras provenientes de animales silvestres, al no requerir de conjugados específicos de especies y eventualmente la realización de estudios epidemiológicos.