Evaluación de aptámeros específicos contra la proteína de la nucleocápside (N) de SARS-COV-2 para el desarrollo de un test rápido de detección de la infección

JULIETA GARCÍA REY; AGUSTINA CERRI; TOMAS BELLANDI; DIEGO CHOUHY; ELISA BOLATTI; ADRIANA GIRI

Rosario

Jornada; II Jornadas de Ciencia y Tecnología de la Fbioyf; 2023

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas - Universidad Nacional de Rosario

Introducción: Desde la identificación del coronavirus pandémico SARS-CoV-21, se han realizadoesfuerzos para desarrollar y producir pruebas diagnósticas que permitan detectar tempranamente lainfección viral (Point-of-Care Testing: POCT)2,3. La mayoría de estas pruebas para COVID-19disponibles en el mercado son de origen extranjero y utilizan anticuerpos monoclonales (AcM).Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra con una estructura tridimensionalespecífica que pueden unirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama de moléculas4.Además, su producción requiere una infraestructura mucho más sencilla y económica que lanecesaria para producir AcM. Aunque se han descrito aptámeros con potencial terapéutico ydiagnóstico para el SARS-CoV-25,6, actualmente existen pocos ensayos comerciales que los utilicen.En este trabajo proponemos la expresión y purificación de la proteína N recombinante de SARS-CoV2 para evaluar la capacidad de unión de cinco aptámeros previamente reportados en bibliografía7,8que luego podrán ser utilizados en el futuro como sensores moleculares en técnicas cromatográficaspara el desarrollo de un test rápido de detección de antígenos para el diagnóstico temprano deCOVID-19.Resultados: La expresión de la proteína N y su dominio de unión a ARN (RBD) fue realizada a partirde plásmidos sintéticos conteniendo las secuencias de la variante Ómicron de SARS-COV-2fusionadas a la secuencia de la proteína GST. Se optimizó un protocolo de expresión aplicadopreviamente en nuestro laboratorio utilizando 12 condiciones de inducción (0.5 y 1 mM de IPTGincubados por 2 hs, 4 hs y overnight, a dos temperaturas diferentes: 30°C y 37°C) hasta obtenerconcentraciones de aproximadamente 10 mg/ml. La purificación de las proteínas se realizó conesferas de sefarosa de 34 μm de diámetro para medir la intensidad de fluorescencia del complejoAptámero-Proteína utilizando citometría de flujo, para luego calcular la constante de disociación (Kd)como medida de afinidad de unión de cada aptámero. Se seleccionaron 2 aptámeros candidatosque presentaron los menores valores de Kd: A-61 (Kd=22.34 nM) y A-15 (Kd=20.8 nM). Paradeterminar si los aptámeros A-61 y A-15 poseían afinidad por diferentes regiones de proteína N serealizaron pruebas de competencia enfrentando las proteínas recombinantes (RBD o N) conconcentraciones crecientes de uno de los aptámeros y manteniendo al otro en concentraciónsaturante. Efectivamente se corroboró que el aptámero A-61 tenía afinidad al dominio RBD y elaptámero A-15 a una región diferente de la proteína N.Conclusiones: Los aptámeros seleccionados son candidatos adecuados para su aplicación en eldesarrollo y puesta a punto de un test rápido de cromatografía lateral para el diagnóstico tempranode SARS-CoV-2. Los resultados derivados de este proyecto sientan las bases para el desarrollobiotecnológico de un test POCT regional con aplicaciones futuras en el diagnóstico de SARS-CoV-2y otras infecciones virales.