Caracterización y selección de aptámeros específicos contra la proteína de la nucleocápside (N) de SARS-COV-2 para la puesta a punto de un prototipo de test rápido

JULIETA GARCÍA REY; AGUSTINA CERRI; TOMAS BELLANDI; DIEGO CHOUHY; ELISA BOLATTI; ADRIANA GIRI

Rosario

Jornada; XVII Jornadas de Ciencias, Tecnologías e Innovación; 2023

Universidad Nacional de Rosario

Introducción: Desde la identificación del coronavirus pandémico SARS-CoV-2, se hanrealizado esfuerzos para desarrollar y producir pruebas diagnósticas que permitan detectartempranamente la infección viral. La mayoría de estas pruebas disponibles en el mercadoson de origen extranjero y utilizan anticuerpos monoclonales (AcM).Los aptámeros son moléculas de ADN o ARN de una sola hebra con una estructuratridimensional que les permite unirse con alta afinidad y especificidad a una amplia gama demoléculas, su producción requiere una infraestructura sencilla y económica.Objetivos: Expresar y purificar la proteína N recombinante de SARS-CoV-2 para evaluar lacapacidad de unión de cinco aptámeros reportados en bibliografía que podrían ser utilizadoscomo sensores moleculares para el desarrollo de un test rápido de detección de antígenos deCOVID-19.Metodología: La expresión de la proteína N y su dominio de unión a ARN (RBD) se realizóa partir de plásmidos sintéticos conteniendo las secuencias de la variante Ómicron de SARSCOV-2 fusionadas a GST. Se optimizó un protocolo de expresión utilizando 12 condicionesde inducción (0.5 y 1 mM de IPTG incubados por 2 hs 4 hs y overnight, a dos temperaturas:30°C y 37°C). La purificación de las proteínas se realizó con esferas de sefarosa de 34 μmde diámetro y la intensidad de fluorescencia del complejo Aptámero-Proteína se midió concitometría de flujo. Dichos valores se utilizaron para calcular la constante de disociación(Kd) como medida de afinidad de cada aptámero con el programa GraphPad Prism.9. Laspruebas de competencia se realizaron enfrentando las proteínas recombinantes conconcentraciones crecientes de uno de los aptámeros y manteniendo al otro en concentraciónsaturante.Resultados: Se logró optimizar la expresión de ambas proteínas bajo las condiciones: 0.5mM de IPTG a 4 hs de incubación a 37°C, obteniéndose concentraciones aproximadas de 10mg/ml.Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (Figura 1), se seleccionaron 2 aptámeros quepresentaron los menores valores de Kd: A-61 y A-15 y se corroboró, mediante los análisisde competencia, que los mismos se unían a regiones diferentes de la proteína N