PUESTA A PUNTO Y DETERMINACIÓN DE VALORES BASALES DE ABERRACIONES CROMOSÓMICAS E ÍNDICE MITÓTICO EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE CAIMAN LATIROSTRIS (YACARÉ OVERO), COMO MARCADORES DE GENO Y CITOOXICIDAD

CHACÓN CAMILA FELISA; EVELYN CECILIA LÓPEZ GONZÁLES; GISELA LAURA POLETTA

Santa Fe

Congreso; XXII Encuentro de Jóvenes Investigadores; 2018

Encuentro de Jóvenes Investigadores de la Universidad Nacional del Litoral

INTRODUCCIÓNLas especies de cocodrílidos están escasamente estudiadas con respecto a la estructura cromosómica, que es esencial para la conservación de la integridad genética de las poblaciones nativas (López González et al., 2015). C. latirostris es una de las dos especies de cocodrilianos que habitan en Argentina (Larriera et al., 2008). En nuestro país, como consecuencia de la expansión de las fronteras agrícolas en los últimos años, muchas áreas de la distribución geográfica de esta especie han quedado superpuestas con regiones de intensa actividad agrícola. Diferentes ensayos a corto plazo (ECP), conocidos como biomarcadores de genotoxicidad, se utilizan para evaluar el daño cromosómico y a la molécula de ADN, inducido por agentes físicos y/o químicos. En C. latirostris hasta el momento, se han utilizado el test de micronúcleos y el ensayo cometa debido a su sensibilidad y facilidad de aplicación (Poletta et al., 2008, 2009; 2011; López González et al., 2013; 2017).El test de aberraciones cromosómicas (AC) y el índice mitótico (IM) son ECP que permiten la detección temprana de los efectos producidos por agentes que causan daño cromosómico y / o alteraciones en la cinética celular, proporcionando conjuntamente gran información sobre sus mecanismos de acción. Hasta el momento, se habían realizado avances en las condiciones óptimas para el cultivo de linfocitos de sangre periférica (LSP) para el análisis de metafases de buena calidad (López González et al., 2015), pero la técnica de AC e IM no se habían aplicado en esta especie ni en ninguna otra especie de cocodriliano.OBJETIVOS:-Poner a punto la determinación de Aberraciones Cromosómicas (AC) e Índice Mitótico (IM) en LSP de C. latirostris.-Determinar los valores basales de AC e IM en la especie y caracterizar los tipos de AC más frecuentes de acuerdo a los antecedentes bibliográficos.-Determinar la sensibilidad de estas técnicas como marcadores de genotoxicidad y citotoxicidad en C. latirostris, en respuesta a la exposición in vitro a un agente genotóxico y citotóxico conocido como el MMS.METODOLOGÍA:Se llevó a cabo un ensayo de exposición in vitro de sangre entera al conocido agente genotóxico Metil-metanosulfonato (MMS) a 10 y 20 μM, y un control negativo (CN) sin la exposición a dicho agente. Todos los tratamientos se realizaron por duplicado. Para la evaluación de AC, se analizaron metafases correspondientes a ambas replicas. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena espinal (Myburgh et al., 2014) de tres juveniles de C. latirostris pertenecientes al Proyecto Yacaré (MUPCN / MMA, Santa Fe), con jeringas heparinizadas. Siguiendo el método propuesto por Amavet et al. (2003) para el análisis del cariotipo en C. latirostris (2n = 42) y las modificaciones introducidas por López González et al. (2015), se realizaron cultivos celulares para obtener metafases de calidad y cantidad necesarias para el análisis AC e IM. Brevemente, se usó RPMI 1640 como medio de cultivo suplementado con 20% de suero bovino fetal, antibióticos para evitar la contaminación del cultivo, fitohemaglutinina como agente mitógeno de linfocitos y colchicina para la detención de la división celular en metafase. Los cultivos se incubaron a 29-30 ° C durante 72 hs. Después de la cosecha, se realizaron goteos sobre portaobjetos a 50 ° C. Se tiñeron con una solución 1:10 de Giemsa en agua estabilizada (pH = 6,8) durante 10 minutos.Índice mitótico (IM): se calculó a partir del análisis de 1000 linfocitos estimulados por muestra y se expresó como porcentaje, de la siguiente manera (Fla 1): Fla 1: %IM: (Número de metafases / Número total de linfocitos estimulados) × 100Frecuencia de Aberraciones cromosómicas (AC): se analizaron en 100 metafases (50 de cada réplica) y se clasificaron como monosomía, nulisomía (Aberraciones numéricas); fragmento tipo cromátide, dobles diminutos, cromosomas sin centrómero, gaps y cromosomas dicéntricos (Aberraciones estructurales) (Fla 2).Fla 2: Incidencia de metafases aberrantes (%): (Número total de metafases aberrantes / Cantidad total de metafases contadas) × 100Teniendo en cuenta la sensibilidad previamente demostrada para el test de MN como marcador de clastogénesis/aneugénesis en esta especie, se incorporó también la determinación de Frecuencia de micronúcleos (FMN), con el objeto de aumentar la caracterización de los efectos del MMS y tomarla como referencia para comparar la respuesta obtenida con los nuevos biomarcadores propuestos (Fla 3).Fla 3: %FMN: Número de células con MN / 1000 eritrocitos contadosLas muestras se observaron con un microscopio (Nikon Eclipse E200, 1000x), y las imágenes se registraron con el programa Paint 3D para análisis de Windows a CA.RESULTADOSLos resultados indicaron diferencias significativas en el IM (p