SOBREXPRESIÓN DE LA ENZIMA GLUCOQUINASA USANDO EL SISTEMA HOMÓLOGO PTCINDEX EN EPIMASTIGOTES DE TRYPANOSOMA CRUZI

ANDREA RAMÍREZ; EDWAR VALERA; GABRIELA GOTTBERG; JUAN CONCEPCIÓN; ANA CÁCERES

Vargas

Congreso; LXV Convención anual ASOVAC; 2015

Universidad Simón Bolívar

El metabolismo energético de Trypanosoma cruzi está basado fundamentalmente en lautilización de glucosa como fuente de carbono y energía. Todos los miembros de la familiaTrypanosomatidae poseen glicosomas que albergan gran parte de la vía glicolítica. Laprimera reacción de la glicólisis es la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato (G6P),y en T. cruzi es catalizada por dos enzimas, hexoquinasa (HK) y glucoquinasa (GlcK);diferencias importantes entre HK y GlcK sugieren que ellas ejercen funciones fisiológicasdistintas. Éste trabajo pretende evaluar los efectos que tiene la sobrexpresión de la GlcKsobre el metabolismo del epimastigote, usando el sistema homólogo e induciblepTcINDEX. Para ello, se obtuvo la línea celular (pLEW-pTcINDEXGlcK) que expresa lapolimerasa de T7, el represor de tetraciclina (TetR) de E. coli y la GlcK. La sobrexpresiónde la GlcK, inducida con 5 µg/ml de tetraciclina, fue verificada mediante RT-PCR. Losepimastigotes recombinantes fueron cultivados en presencia y ausencia del inductor, y semonitoreó su crecimiento, se inmunodetectó y midió la actividad específica GlcK, elconsumo de glucosa y aminoácidos. La localización subcelular de la GlcK sobrexpresadafue confirmada mediante inmunofluorescencia. Al inducir la sobrexpresión de laglucoquinasa en los parásitos, el crecimiento disminuye (68,9%), su forma se hace másalargada, baja el consumo de glucosa (90%) e incrementa el consumo de aminoácidos(14.4%). Este fenotipo revierte lentamente al eliminar el inductor del medio. La actividadGlcK incrementa 4 veces, respecto al control, siendo proporcional al nivel de expresiónregistrado mediante RT-PCR y western-blot. La inmunofluoresencia demostró que la GlcKsobrexpresada está localizada en el glicosoma. Estos resultados sugieren que la GlcKparticipa en la regulación del flujo energético dentro del glicosoma, un incremento en suactividad desvía mayor cantidad de G6P hacia la ruta PPP, se genera menos ATP y enconsecuencia los parásitos dejan de crecer.