CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE UN CATALIZADOR INNOVADOR PARA LA PRODUCCIÓN DE LECHE REDUCIDA EN LACTOSA

RAMÍREZ GUTIÉRREZ, ANDREA CAROLINA; BRACHO OLIVEROS, JUAN PABLO; CAVALITTO, SEBASTIAN; ORTIZ, GASTON

Posadas, Misiones

Simposio; SAPROBIO 2021 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos: transfiriendo biotecnología para el desarrollo; 2021

Universidad Nacional de Misiones

La β-galactosidasa o lactasa es la enzima que hidroliza lactosa en glucosa y galactosa. Dicha enzima, es ampliamente utilizada por la industria láctea en producir leche reducidaen lactosa (LRL) y galactooligosacáridos (GOS) los cuales poseen actividad prebiótica.Para su empleo, esta enzima debe obtenerse con alto rendimiento y pureza. Dado que, la presencia de otras proteínas contaminantes como proteasas conducen a la formación de productos secundarios que conduzcan a propiedades organolépticas no deseadas. Sin embargo, la obtención de una enzima con alto grado de pureza requiere de técnicas cromatográficas de afinidad las cuales conducen a un aumento significativo en el costo final del producto (catalizador). En nuestro grupo de trabajo, hemos desarrollado una nueva herramienta biotecnológica para la producción, purificación e inmovilización de proteínas recombinantesempleando un novedoso sistemade etiquetado molecular. En este sistema,las proteínas recombinantes expresadas ensistemas heterólogos son fusionadas al dominioC-terminal de las proteínas de Capa-Sde Lactobacillus sp. Luego, se emplea la afinidadintrínseca que posee dicho dominiopor las membranas de las bacterias Gram +para realizar la purificación o inmovilizaciónde las proteínas de interés. Considerandolo expuesto, el objetivo de este trabajo fueevaluar el sistema de etiquetado e inmovilización,para desarrollar un catalizador innovadorque permita la producción de β-galactosidasade Bifidobacterium bifidum y supurificación en un único paso de una formaeficiente y económica. Para ello, se realizóla síntesis de una variante truncada de BbgIIde B. bifidum fusionada al C-terminal delSlpA de L. bacillus y se transformaron E. coliBl2aCodonPlus. La producción de la enzimase hizo en cultivos de E. coli con medio LB aescala Erlenmeyer e induciendo con 0,5 mMde IPTG. Posteriormente, los cultivos fueroncosechados por centrifugación durante 5’@5000 g, luego los pellets fueron lavados2 veces con PBS y reconstituidos en bufferde lisis con Lisozima. Para obtener el homogenato,la suspensión de células fue sonicaday centrifugada durante 20’ @ a2000g. A continuación, el lisado se clarificó porfiltración y fue incubado en batch durante 2horas a 25ºC con una matriz constituida porB. subtilis inactivado con formol 3%. De estemodo se logró obtener, la enzima inmovilizadasobre la superficie de Bacillus subtilis.Posteriormente, se realizó la caracterizaciónbioquímica de la enzima inmovilizada. Para1726º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos-Agosto 2021SESIÓN 5ello, se evaluó el efecto de la temperatura,pH y cationes en la estabilidad y actividadde la enzima. Como resultado, se obtuvoque la enzima inmovilizada presenta actividadóptima a pH 6,2 y resulta estable en elrango de pH (4,6-8) durante dos horas reteniendoel 70% de su actividad máxima. Porotro lado, el catalizador presentó actividadóptima en un rango de temperatura de 40-60 °C y mostró buena actividad residual abajas temperaturas. Finalmente bajo condicionesóptimas de pH 6,2 y temperatura de50°C, se determinó la actividad enzimáticade forma comparativa con formulados comerciales,como resultado pudo obtenersevalores de actividad comparables entre ambasenzimas. Estos resultados sugieren que,la β-galactosidasa recombinante de B bifiduminmovilizada sobre B. subtilis posee uncomportamiento similar a las formulacionescomerciales y por lo tanto, la misma resulta promisoria para la producción de LRL.