Generación de un vector baculoviral inducible por quimioterapia y puesta a punto de la transducción en células de adenocarcinoma de pulmón humanas

MARCHESINI ABRIL; AMOROS MORALES, LESLIE CINTHYA; CANDOLFI MARIANELA; ROMANOWSKI VÍCTOR; PIDRE MATÍAS LUIS

Valle Hermoso, Córdoba

Congreso; XLIII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA.; 2023

Sociedad Argentina de Virología

Los baculovirus son virus específicos de artrópodos, poseen un genoma de DNA circulardoble hebra, que varía entre 80 y 180 kpb. El baculovirus tipo Autographa californicaMultiple Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ha sido ampliamente utilizado como vector deexpresión de proteínas heterólogas y, más recientemente, como vector de terapia génica.El cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer a nivelmundial. La mayoría de los pacientes con cáncer metastásico padecen una enfermedadmultirresistente. Los transportadores ABC (ATP-binding cassette), en particular ABCB1 óMDR1 (multidrug resistance protein 1) pueden aportar a la resistencia del cáncer a terapiasconvencionales, como lo son la quimio y la radioterapia. Trabajos previos muestran queestos transportadores son inducibles por especies reactivas de oxígeno.Con el fin último de desarrollar vectores de terapia génica inducibles por quimioterapia ycaracterizar la inducción del promotor de MDR1 (pMDR1) con diferentes quimioterápicos ycondiciones de estrés oxidativo, nos propusimos como objetivo diseñar un baculovirusrecombinante reportero (Ac-pMDR1-dTomato) que codifica la proteína fluorescente dTomatobajo la regulación de pMDR1, generado a través de un sistema de clonado de GoldenGate(PluriBAC).Para evaluar las mejores condiciones de transducción de la línea celular A549 deadenocarcinoma de pulmón, utilizamos un baculovirus recombinante que posee el ORF dedTomato bajo un promotor constitutivo, como lo es promotor de citomegalovirus(Ac-dTomato) disponible en el laboratorio. Alcanzando una eficiencia de transducciónsuperior al 40% a las 72hs post-tratamiento (MOI=100).Luego evaluamos la viabilidad celular de la línea celular A549 mediante tinción con cristalvioleta frente a diferentes quimioterápicos (Cisplatino y Temozolomida de 0 a 10μg/ml,respectivamente), en una búsqueda preliminar de las mejores condiciones de inducción depMDR1.Por último, ensayamos diferentes condiciones de inducción de pMDR1 que nos permitieranalcanzar un porcentaje de células dTomato positivas semejante al obtenido con Ac-dTomato.Realizamos ensayos de transducción en la línea celular A549 con Ac-pMDR1-dTomato(MOI=500). A las 2 horas post transducción las células fueron tratadas con diferentesconcentraciones de cisplatino (1-5 μg/ml) y temozolomida (8-10μg/ml), para luego evaluar elporcentaje de células dTomato positivas a diferentes tiempos por epifluorescencia.Como resultado, observamos un 20% de inducción de pMDR1 en las células tratadas con 3μg/mll de cisplatino (Student’s t test), pero no así en las tratadas temozolomida a las 72hspost-tratamiento.Estos resultados nos permiten avanzar en la comprensión del rol de los transportadoresABC en la resistencia a los tratamientos convencionales del cáncer, así como en suaplicación en la generación de herramientas biotecnológicas, tales como el desarrollo devectores de terapia génica inducibles por quimioterapia.