PluriBAC: un sistema modular versátil basado en baculovirus para expresar múltiples genes heterólogos

AMOROS MORALES, LESLIE CINTHYA; MARCHESINI ABRIL; GOMEZ BERGNA, SANTIAGO; GARCIA FALLIT, MATÍAS; TONGIANI, SILVANA E.; VÁSQUEZ, LARISA; FERRELLI, MARÍA LETICIA; VIDELA-RICHARDSON, GUILLERMO A.; CANDOLFI, MARIANELA; ROMANOWSKI, VÍCTOR; PIDRE, MATIAS L.

Valle Hermoso, Córdoba

Congreso; XLIII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA.; 2023

Sociedad Argentina de Virología

El baculovirus AcMNPV (Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus) ha sido ampliamente utilizado para la producción de bioinsumos. En ese sentido, el mejoramiento de las tecnologías usadas para la producción de AcMNPV recombinantes (recAcMNPV) resulta de interés. El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollo de un nuevo sistema 58 llamado PluriBAC, basado en la tecnología de clonado por Golden Gate utilizando enzimas de restricción (ER) tipo IIS para el ensamblado simultáneo de múltiples fragmentos en un mismo vector. PluriBAC consta de tres niveles que permiten la combinación de módulos. Los vectores del nivel 1 poseen las secuencias compatibles con los módulos provenientes del nivel 0. Asimismo, a partir del nivel 1, se obtendrá el plásmido del nivel 2 con el ensamblado final de los múltiples bloques. Mientras que los vectores del nivel 2 contienen secuencias que permiten la recombinación homóloga con el bácmido bApGOZA, plásmidos del nivel 1 se adaptaron para permitir la generación de recAcMNPV a través de trasposición en bacterias (Bacto-Bac). La funcionalidad del sistema se evidenció mediante la generación de diferentes recAcMNPV que expresan la proteína reportera Citrine: uno obtenido mediante recombinación homóloga a partir de vectores de nivel 2 (Ac-GZ-Cit), y otro obtenido a partir de un vector de nivel 1 adaptado para el sistema Bacto-Bac incluyendo además la resistencia al antibiótico Espectinomicina y las secuencias Tn7R y Tn7L (Ac-BtBCit). Las reacciones de Golden Gate fueron incubadas 10 min a 37°C y 15 min a 16°C por 30 ciclos. Los recAcMNPV se generaron mediante la co-transfección de células de insecto High Five con el vector de nivel 2 y el bácmido o mediante la transformación del plásmido de nivel 1 en células DH10Bac, y la posterior transfección de células de insecto con el bácmido recombinante. Por un lado, el virus Ac-GZ-Cit fue utilizado para transducir células gliales tanto in vitro como in vivo. Para los ensayos in vitro, se incubaron astrocitos murinos y células G09 de glioblastoma derivadas de pacientes por 2 hs con el recAcMNPV (MOI = 750). En cuanto a los ensayos in vivo, se utilizaron ratones C57BI/6 naïve y portadores de gliomas. Se inocularon los ratones con 5x108 partículas virales por vía intracraneal. Pudimos observar la expresión del gen reportero tanto en células en cultivo como en cortes de cerebros mediante microscopía de epifluorescencia. Por otro lado, la exitosa generación del Ac-BtB-Cit se evidenció en bacterias mediante la selección con el antibiótico, la aparición de colonias blancas en presencia de x-gal y mediante microscopía de epifluorescencia en células de insecto. En este trabajo presentamos un sistema versátil, basado en Golden Gate, para la generación de baculovirus recombinantes. Presentamos a modo de ejemplo dos baculovirus recombinantes generados con este sistema que conservaron las capacidades intrínsecas de los mismos y algunas de sus posibles aplicaciones.