Modificación de nanoanticuerpos anti-NS1 para el desarrollo de un ELISA sandwich aplicable al diagnóstico temprano del dengue

PAVAN MARÍA FLORENCIA; PEREZ VIDAKOVITS LAURA; MCLNERNEY GERALD; HANKE LEO; GARCÍA CYBELE; IBAÑEZ LORENA ITATÍ

Córdoba

Otro; XLIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2023

Sociedad Argentina de Virología

El dengue es una enfermedad viral causada por los 4 serotipos del virus del dengue (DENV 1-4), la cual es transmitida principalmente a través de la picadura de mosquitos Aedes aegypti. En Argentina, se registró en 2023 la mayor epidemia de dengue con alrededor de 125 mil casos confirmados. El diagnóstico temprano de los casos, luego de una infección primaria o secundaria, es esencial para el manejo terapéutico de los pacientes y el desarrollo de sistemas de vigilancia epidemiológica. La detección de la proteína no estructural 1 (NS1) del virus es uno de los métodos de elección para el diagnóstico de la fase aguda ya que la proteína se secreta al torrente sanguíneo desde células infectadas durante los primeros días del inicio de los síntomas. Los kits de diagnóstico utilizados se deben importar y no están ampliamente disponibles. Nuestro objetivo es desarrollar un ELISA sándwich utilizando nanoanticuerpos (VHHs) para la detección temprana de individuos infectados con dengue. Los VHHs corresponden a la región variable de los anticuerpos de cadena pesada de camélidos y poseen ventajas en comparación con los anticuerpos monoclonales, como alta afinidad, especificidad, estabilidad y solubilidad, y bajo costo de producción. Para la obtención de los VHHs anti-NS1 se inmunizaron dos llamas y se construyó una biblioteca de genes VHHs desde la que se seleccionaron 11 VHHs únicos mediante la técnica de panning con display de fagos. Se estudió la capacidad de los VHHs de capturar la NS1 de los 4 serotipos de DENV en diferentes condiciones: según el tipo de placa, utilizando diferentes agentes bloqueantes y distintas concentraciones de NS1. Los VHHs que capturaron menores concentraciones de NS1 fueron modificados para mejorar su capacidad como anticuerpos de captura. Se generaron VHHs fusionados a una secuencia de pegado a plástico (VHH PSW), VHHs bivalentes y VHHs fusionados al dominio FC (VHHs Fc). Se determinó que las moléculas bivalentes y unidas al dominio Fc mejoran significativamente la captura de la NS1 en comparación con los VHHs monovalente o PSW. También se generaron VHHs unidos a HRP o a la fosfatasa alcalina para ser utilizados como moléculas de detección. Una vez establecido el mejor VHH detector, se estudiará la capacidad del ensayo diagnóstico de detectar NS1 en sobrenadante de células infectadas y se determinará la sensibilidad y especificidad del mismo utilizando muestras de suero de pacientes sanos e infectados con dengue. En este trabajo demostramos que es posible seleccionar, caracterizar y modificar VHHs que reconocen la NS1 de los 4 serotipos de DENV de manera sencilla y con altos rendimientos. El desarrollo de un kit diagnóstico basado en nanoanticuerpos permitirá la detección temprana de individuos infectados con dengue, sin necesidad de infraestructura compleja ni profesionales especialmente entrenados, en forma descentralizada, sustituyendo importaciones de insumos y a bajo costo.