Los cuádruplex de guanina regulan la biogénesis de miARNs en embriones de pez cebra.

STEEMAN, TOMÁS J.; WEINER, ANDREA M. J.; DAVID, ALDANA; BINOLFI, ANDRES; CALCATERRA, NORA B.; ARMAS, PABLO

Congreso; Encuentro Binacional del ARN; 2022

Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras secundarias no canónica de ácidos nucleicos formadas en secuencias ricas de guanina, predominantes en regiones regulatorias. Pueden funcionar como reguladores de metabolismo, procesamiento y traducción de ARNm. Los G4s formados en precursores de microARNs (pre-miARNs) puede competir con las clásicas estructuras de tallo-burbuja, impidiendo la maduración mediada por la enzima DICER, o el ensamblaje del complejo miRISC. Debido a que los miARNs cumplen funciones importantes como reguladores durante el desarrollo embrionario, nos propusimos usar embriones de pez cebra (Danio rerio) como organismo modelo para estudiar el efecto de los G4s sobre la maduración y función de los miARNs. Realizamos una búsqueda in-silico de secuencias putativas de G4 (pG4) en pre-miARNs de pez cebra, utilizando la secuencia consenso G3-5N1-7G3-5N1-7G3-5N1-7G3-5N1-7. El pre-miR-150 contiene una pG4 que se solapa parcialmente con la región tallo-burbuja, y que se encuentra evolutivamente conservada en vertebrados. Experimentos de espectroscopía de dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear mostraron que este pG4 es capaz de formarse in-vitro como G4. El gen myb, involucrado en el desarrollo de células hematopoyéticas, fue identificado como un blanco conservado del miR-150. Además, existen reportes con fenotipos claros en embriones de pez cebra sobreexpresantes de miR-150 o silenciados para myb. Por lo tanto, estudiamos el rol in-vivo del G4 presente en el pre-miR-150 microinyectando embriones en estadio de 1-célula con transcriptos in-vitro de pre-miR-150 sintetizados con GTP o 7-deazaGTP (7dG-pre-miR-150), el cual puede formar estructuras secundarias dependientes de enlaces de Watson-Crick, pero no los enlaces de Hoogsten que estabilizan la estructura G4. Los embriones inyectados con 7dG-miR-150 mostraron mayores niveles de miR-150 maduro y menores niveles de myb, así como fenotipos correspondientes a una disminución de myb más marcada (reducción en el tamaño de los ojos y longitud del tronco) que los inyectados con GTP-miR-150. Además, el tratamiento con el ligando piridostatina (PDS, estabilizador de G4) disminuyó los efectos observados con la sobreexpresión con GTP-miR-150, pero no alteró los resultados de 7dG-miR-150, indicando que la formación del G4 podría regular la maduración del miR-150 y los fenotipos asociados. Estos resultados sugieren que el G4 formado en el pre-miR-150 funciona in vivo como una estructura reguladora capaz de competir con la estructura de tallo-burbuja necesaria para el procesamiento de los miARNs. Como perspectivas a futuro se plantea caracterizar con mayor profundidad la competencia entre las estructuras de G4 y tallo-burbuja, así como completar los análisis in vivo de los fenotipos asociados a la disminución de myb.