Desarrollo de una prueba Elisa competición para el diagnóstico de Trypanosoma evansi

DUBOIS, E. F.; FLORENTIN, A. S.; ELÍAS, I. C.; VIOLA, MARÍA NAIR; MONZÓN, C. M.

Formosa

Jornada; XXII Jornadas de Ciencia y Tecnología UNaF; 2019

UNIVERSIDAD NACIONAL DE FORMOSA

DESARROLLO DE UNA PRUEBA ELISA COMPETICIÓN PARA ELDIAGNÓSTICO DE TRYPANOSOMA EVANSIDUBOIS E.F. ¹, FLORENTIN A.S.¹, ELIAS I.C. ¹, NAIR M.V. ¹ MONZÓN C.M. ¹¹Centro de Investigación y Transferencia (CIT Formosa) CONICET. UNaF, Gobierno de la provincia deFormosa.fernando_dubois@hormail.comINTRODUCCIÓNEl Trypanosoma evansi (tripanosomas, Kinetoplastida) es un parásito extracelular, hemoflagelado, que pertenece a la secciónsalivaria. Este flagelado se transmite mecánicamente por diferentes moscas hematófagas, tales como Tabanidae y Stomoxys,así como por el murciélago vampiro Desmodus rotondus. (Hoare, 1972). Este hemoparasito afecta a casi todas las especies demamíferos, la susceptibilidad no sólo es muy variable de una especie a otra, sino también puede ser variable de una zonageográfica a otra (Desquesnes, 2013). En Argentina se reportaron numerosos casos en la provincia de Formosa en las últimasdécadas, atacando principalmente a equinos, produciendo una enfermedad conocida como ?Mal de caderas? en relación a laparálisis que produce en el tren posterior de los équidos. (Monzón et al 1990, 1995). La enfermedad se caracteriza por tener uncurso agudo y crónico con fiebre intermitente, anemia, pérdida de peso, edemas, ocasionalmente trastornos locomotores yhasta la muerte de los mismos. El diagnóstico clínico de la infección por T. evansi sigue siendo difícil debido a que los signosson muy variados e inespecíficos. El diagnostico parasitológico consiste en la demostración del parásito en la sangre o tejidosfluidos de animales infectados, para lo cual se emplean métodos como frotis teñidos, técnicas de concentración porcentrifugación e inoculación de animales susceptibles. Para el diagnóstico serológico, el CIT Formosa ha desarrollado yvalidado una prueba ELISA anticuerpo anti-Trypanosoma evansi para diagnóstico en equinos (Monzón, 2000), pero hasta lafecha no se dispone de un diagnostico serológico con anticuerpos monoclonales lo que presupone una mejor estandarización delos reactivos y los resultados. El objetivo de este trabajo es comunicar los resultados parciales de una prueba ELISAcompetición (cELISA) con anticuerpos monoclonales.MATERIALES YMÉTODOSEn primera instancia, se llevó adelante el cultivo de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales Mab 2-4 F6(Monzón C.M 2006), siguiendo la metodología descripta. Se evaluaron concentraciones de antígeno en placa, suerosproblema y concentraciones del anticuerpo monoclonal. Los resultados de las diluciones de los sueros controles estánexpresados en la diferencia de los porcentajes de inhibición (PI) obtenida entre los sueros positivos y negativos.1. Sobre una fila de pocillos de placa ELISA, previamente sensibilizada con antígenos a concentraciones determinadassegún metodología descripta por Monzón, CM. (2000), colocar por duplicado 100 micro litros de los sueros problemasdiluidos a concentraciones determinadas con PBST. Llevar a estufa de 37°C por una hora2. Retirar de cada uno de los pocillos 50 ul y agregar inmediatamente 50 ul del anticuerpo monoclonal diluidos en PBSTen concentración determinada. Llevar a estufa de 37°C por una hora.3. Vaciar los pocillos, colocar buffer PBST de lavado por un minuto, retirar el PBST y lavar nuevamente dos veces por 5minutos en cada oportunidad.4. Colocar conjugado (Goat Anti mouse IgMu) en una dilución 1/1000 en PBST (previamente titulado). Llevar a estufade 37°C por una hora.5. Lavar nuevamente en la forma descripta en el paso 3.6. Colocar revelador que consiste en ABTS más agua oxigenada (Monzón, CM. 2000).7. Llevar a 37°C por una hora.8. Leer en lector ELISA.9. Calculo del porcentaje de Inhibición:Resúmenes XXII Jornadas de Ciencia y Tecnología263Grafico 1: Diluciones de sueros controles positivos y negativos expresadosen sus diferencias de PI al enfrentar distintas concentraciones del Mab.Grafico 3: Diluciones de suero controles positivos y negativos, expresadosen sus diferencias de PI, manteniendo una concentración de 1/100 del Mab.A partir de estos resultados, se evaluó el comportamiento delanticuerpo monoclonal en diferentes concentracionesmanteniendo una concentración de los sueros controles en1/100.En este grafico se observa que las diluciones 1/40 y 1/100mostraron la mayor diferencia entre el promedio de los suerospositivos y negativos de referencia, expresados en porcentajede inhibición.Grafico 2: Diferencia de los porcentajes de inhibición (PI) obtenida entrelos sueros controles positivos y negativos a una concentración 1/100 frentea diferentes diluciones del Mab 2-4 F6.En el grafico 3 queda evidenciado que, en una concentracióndel anticuerpo monoclonal en 1/100, la mayor diferencia entreel promedio de los sueros positivos y negativos se obtienecuando se trabaja en una dilución de 1/100 con PBST de loss u e r o s p r o b l e m a s .En el grafico 4 se muestra que, con una dilución de 1/100 de lamonoclonal y de los sueros controles, la mayor diferenciaobtenida entre los sueros problemas es a una dilución 1/130del antígeno en placa.Grafico 4: Respuesta de los sueros controles positivos y negativos,expresados en sus diferencias de PI, manteniendo una concentración de 1/100del Mab y en diferentes diluciones del antígeno en placa.Bajo estas condiciones establecidas se realizó una prueba con 10 sueros positivos al parasitológico y al ELISA indirectodescripto por Monzón, CM. (2000) y 10 sueros negativos de zona libre. En la siguiente tabla y grafico se observan los resultadosobtenidos.Animales Media D.E. CV Mín MáxNegativosN=10 21,69 7,11 32,81 10,37 28,28PositivosN=10 59,92 10,53 17,57 45,14 75,52Tabla 1: Resultados de la prueba ELISAS competicióncon sueros problemas.Resúmenes XXII Jornadas de Ciencia y Tecnología264Grafico 5: resultados obtenidos con el ELISA competición en equinosDISCUSIÓNEn las condiciones en las que se realizó la prueba; el anticuerpo monoclonal es susceptible de ser inhibido por antígenoscirculantes libre, o inmunocomplejos antígeno-anticuerpos y también por la competencia de anticuerpos que se une al antígenoen la placa. De allí la necesidad de evaluar sueros de animales en estado de infección activa y aquellos que superaron laenfermedad mediante tratamiento farmacológico especifico.Si bien los resultados obtenidos para la prueba ELISA competición son preliminares, podemos observar una claradiferenciación entre los animales positivos y negativos. Estos datos indican que la ELISAcompetición podría ser utilizada parael diagnóstico de Trypanosoma evansi en equinos, indicando que el animal está o estuvo en contacto con los parásitos, requisitoque debe ser negativo para el tránsito internacional de los mismos. Por otra parte, esta prueba podría ser utilizada en otrasespecies susceptibles. Sin embargo, deberíamos probar en una mayor cantidad de animales y en diferentes especies para poderllegar a tener una conclusión más sólida al respecto de esta prueba.BIBLIOGRAFÍADesquesnes, M., Holzmuller, P., D.-H. Lai, A. Dargantes, Z.-R. Lun, and S. Jittaplapong, 2013. ?Trypanosoma evansi andSurra: a review and perspectives on origin, history, distribution, taxonomy, morphology, hosts, and pathogenic effects,?BioMed Research International, vol., Article ID 194176, 22 pages, 2013Hoare CA, 1972: The trypanosomes of mammals Oxford, Blackwell Scientific Publications;:1-749Monzón, C.M., Mancebo, O.A., Roux, J.P., 1990. Comparison Between Six Parasitological Methods for Diagnosis ofTrypanosoma evansi in the Subtropical Area of Argentina. Veterinary Parasitology, 36: 141-146.Monzón,C.M.; Jara,G.A. and Nantulya,V.M. 1995 : "Sensitivity of antigen ELISA Test for detecting Trypanosoma evansiantigen in horses in the subtropical area of Argentina". Journal of Parasitology, 81 (5): 806-808.Monzón C.M. 2000.Validación de una prueba inmunoenzimática indirecta para la detección de anticuerpos anti-Trypanosomaevansi en equinos de Argentina. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 19 (3), 810-818.Monzón C.M., 2006. 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