Clonado y expresión de la proteína caltrin de toro en Escherichia coli

SOTTILE, AE; MIHELJ, P; CORONEL, CE; VAZQUEZ-LEVIN, MH

San Miguel de Tucumán

Congreso; 3era Reunión Conjunta de Sociedades de Biología de la República Argentina; 2015

Asociación de Biología de Tucumán

La proteína Caltrin (calcium transport inhibitor) de la secreción de vesícula seminal de toro se une a los espermatozoides durante la eyaculación e inhibe la incorporación de Ca2+ extracelular. Así, previene la exocitosis acrosomal espontánea y aumenta la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides epididimarios. Su purificación de plasma seminal es compleja, por lo que diseñamos un sistema de expresión de Caltrin bovina-recombinante (Caltrin-rec) en bacterias. El ARN aislado de vesícula seminal fue purificado usando un protocolo estándar. El ADN copia fue generado por retro-transcripción y amplificado por PCR usando cebadores específicos, conteniendo secuencias para el clonado direccional con enzimas de restricción. El fragmento amplificado y digerido fue insertado en un plásmido de expresión procariota. El plásmido con/sin (control) el inserto fue transformado en bacterias E.coli BL21(DE3) competentes. Cuatro clones recombinantes fueron seleccionados para evaluar la expresión de Caltrin-rec luego de la inducción de cultivos bacterianos líquidos con IPTG. Por SDS-PAGE, se detectó una banda proteica de 5,5 kDa, en la que se identificaron péptidos de Caltrin bovina por HPLC-MS/MS. Para optimizar la expresión de Caltrin-rec se ensayaron diferentes protocolos de inducción de la expresión proteica; las células fueron lisadas por ultrasonido y analizadas por SDS-PAGE. El empleo de Caltrin-rec contribuirá a profundizar los estudios sobre su rol en el proceso de la fecundación.