Caracterización molecular de una cepa virulenta del virus Junín

THOMAS PABLO D.; SCALISE MA.LUJÁN; TOMATIS CARLA; FERRER MA. FLORENCIA; GÓMEZ RICARDO M.

Valle Hermoso, Córdoba

Congreso; XLIII Reunión Científica Anual 2023 DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA (Reunión SAV 2023); 2023

Sociedad Argentina de Virología (SAV)

El virus Junín (JUNV), clasificado dentro de la familia Arenaviridae, género mammarenavirus, es el agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina (FHA), una enfermedad endémica de nuestro país. Su principal reservorio es el ratón Calomys musculinus. Los humanos pueden contagiarse por vía aérea o contacto directo de material contaminado. Desde el descubrimiento de JUNV, se aislaron diversas cepas de pacientes con FHA, incluyendo la cepa P3441 (P) que ha sido utilizada en nuestro laboratorio como modelo patogénico de JUNV. La cepa atenuada vacunal Candid 1 (C#1) fue obtenida por pasajes consecutivos en línea celular. Diversos estudios previos entre ambas cepas mostraron diferencias en posibles mecanismos patogénicos, pero se desconoce la base molecular ya que,si bien la secuencia de C#1 es conocida, la de P aún no.El trabajo tiene como objetivo conocer la secuencia genómica de la cepa P, realizar un análisis comparativo con la cepa C#1 y generar herramientas moleculares para profundizar su estudio.Se diseñaron 17 pares de primers basándose en la secuencia de C#1 y regiones conservadas. Se obtuvo el ARN viral empleando Trizol según las instrucciones del fabricante y se generaron ADNc por transcripción reversa empleando los primers reversos. Los productos fueron amplificados por PCR y clonados en el vector pGEM-T Easy Vector (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos fueron secuenciados empleándose el método de Sanger y el servicio de Macrogen, Corea. Las secuencias obtenidas fueron alineadas y comparadas con otras cepas empleando el programa UGene y MegaX. Los servidores ColabFold se utilizaron para realizar modelos tridimensionales de las proteínas, verificadas con los algoritmos PROCHECK y VERIFY3D, refinados con el servidor ReFOLD3 y con los programas PyMol y Chimera. Seguidamente se hicieron análisis termodinámicos del impacto de las diferencias detectadas entre C#1 y P. Finalmente, se realizó un análisis de interfase empleando el programa de predicción de acoplamiento proteína-proteína HADDOCK.Se obtuvo la secuencia de la región codificante de P. Se realizaron alineamientos comparativos con C#1 y otras cepas. Se detectaron diferencias aminoacídicas para los genes de Z (2), N (8), GPC (7) y L (46). Algunas, como V64G de Z parece desestabilizar la estructura en C#1 sin interferir en la interfaz con eIF4E. Finalmente, los genes de las 4 proteínas fueron clonados en el vector pGEM-T y subclonados en los vectores pDsRed-Monomer-N1 y pEGFP-N3 generándose los siguientes vectores de expresión eucariota con tags fluorescentes: pDsRed-N de C#1 y P, pEGFP-Z para C#1 y P, pEGFP-GPC de P y pEGFP-L de P.Se realizó un análisis de la cepa P, demostrando que comparte varios elementos de otras cepas patogénicas mientras presenta elementos únicos. Se planea profundizar este estudio utilizando las herramientas generadas, haciendo énfasis en la respuesta antiviral celular.