Avances en el estudio morfológico y molecular de dos especies nuevas de Hypogeococcus Rau (INSECTA: HEMIPTERA: PSEUDOCOCCIDAE) asociadas a Cactaceae de Salta (ARGENTINA)

MELCHERT, NICOLÀS ALEJANDRO; CLAPS, LUCÍA ELENA

San Miguel de Tucumán

Jornada; Jornadas de Jovenes Investigadores; 2016

CIUNT

Hypogeococcus Rau posee 11 especies a nivel mundial, de las cuales 4 se encuentran en Argentina: Hypogeoccocus pungens(Granara de Willink), Hypogeococcus festerianus (Lizer y Trelles), Hypogeococcus spinosus (Ferris), e Hypogeococcus concordiensis (Williams y Granara de Willink), estas se encuentran asociadas a mirtáceas, cactáceas, amarantáceas y portulacáceas. Años atrás, H.pungens fueron utilizadas como controladores biológicos de Harrisia martinii, una cactácea invasiva en Sudáfrica y Australia. Hoy en día, además, las especies de Hypogeococcus tienen importancia económica debido a que constituyen plagas invasoras de cactus columnares en Puerto Rico y otras islas del Caribe y aún no se conoce con exactitud el origen de dicha plaga. Por esta razón actualmente se realiza una revisión del género utilizando colecciones entomológicas y material recolectado en diferentes puntos del país. Cabe destacar que existe mucha confusión dentro del género ya que ciertas características diagnosticas dejan afuera a alguna de sus especies y por eso es necesario aportar claridad a esto con un estudio morfológico apoyado con datos moleculares. El objetivo de este trabajo es brindar avances en la descripción morfológica de dos especies nuevas para la ciencia del género Hypogeoccocus y presentar un protocolo para la extracción y amplificación de ADN de individuos del género Hypogeococcus que permita obtener datos de filogenia molecular para apoyar la descripción tradicional. El material estudiado fue recolectado en las localidades de Los Lapachos, provincia de Salta (Hypogeococcus sp nov 1), asociada a Harrisia pomanensis y Alemanía, provincia de Salta (Hypogeococcus sp nov 2) asociada a Cleistocactus smaragdiflorus. Todo el material recolectado fue acondicionado en preparados permanentes utilizando las técnicas clásicas de clarificación, deshidratación y montaje y luego fue depositado en la colección Instituto Fundación Miguel Lillo, Tucumán (IFML) y las observaciones se realizaron utilizando microscopio (MO) óptico de campo claro y de contraste de fases, además se realizaron observaciones con microscopio electrónico de barrido (MEB). La puesta a punto de las técnicas para la extracción y amplificación se realizó en los laboratorios de la Fundación para el Estudio de las Especies Invasivas (FUEDEI), Hurlingham, Provincia de Buenos Aires. Para realizar la extracción de ADN se utilizó el kit RedExtract-N-AmpTM de extracción para PCR de la marca Sigma-Aldrich. Se seleccionaron individuos de Hypogeococcus sp nov 1, sp nov 2, e Hypogeococcus pungens y se colocaron en tubos eppendorf. En cada tubo se colocaron 100 µl de ?Extraction Solution? y 25 µl de ?Tissue Solution?, y luego se trituraron algunos de los individuos contenidos en los tubos mientras que otros se dejaron como estaban para control. Se mantienen los tubos en reposo durante 10 minutos y se los lleva a baño maría por tres minutos. Se agrega 100 µl de la solución ?Neutralizer?, se mezcla en vortex y se centrifuga durante un minuto a 4000 rpm, se descarta el exoesqueleto. Para realizar la PCR se coloca en 25 tubos eppendorf: 5 µl de agua, 10 µl de REDExtract-N-Amp PCR Reaction Mix, 0,5 µl de primer F, 0,5 µl de primer R y por ultimo 4 µl del extracto de ADN producido anteriormente en su tubo correspondiente. Se utilizaron primers pertenecientes a la Citocromo C oxidasa 1, (una secuencia de ADN mitocondrial especie especifica) y al Factor de Elongación 1 Alfa. Los tubos se ubican en el termociclador y se da inicio a una PCR clásica de 35 ciclos con una duración de aproximadamente tres horas. Para corroborar la obtención de productos de la reacción de amplificación, se siembra el extracto amplificado de los diferentes tubos en gel de agarosa y TAC, y se lleva a cabo una corrida electroforética durante media hora, al terminar, se tiñe el gel con la tinción fluorescente para ácidos nucleicos GelRed por otros 30 minutos y luego se observan los resultados con luz UV. Los caracteres utilizados para separar las especies de Hypogeococcus son: Disposición de setas cónicas y flageladas en los segmentos abdominales, cantidad de cerarios y tipos de setas que los componen, presencia o ausencia de setas cónicas en el tórax. Hypogeococcus sp nov 1 posee escasas setas cónicas en el tórax, en los segmentos abdominales la disposición de las setas es desordenada diferente de lo que se ve en especies como Hypogeococcus pungens donde la disposición sigue un patrón ordenado. Hypogeococcus sp nov 2 no posee setas cónicas en el tórax, las setas cónicas y flageladas en el abdomen tienen un patrón diferente de lo que se ve en H. pungens y H. festerianus. En cuanto a la reacción de PCR, los tubos en los que el ejemplar no fue triturado para realizar la extracción de ADN no mostraron bandas de amplificación, mientras que los ejemplares que fueron triturados, en su mayoria amplificaron correctamente para ambos primers según se vio en los resultados de la electroforesis. Esto nos indica que para una extracción eficiente de estos insectos de tamaño minúsculo es necesaria la destrucción del material.