Péptidos y peptidomiméticos con actividad anticolinesterásica 

SANCHIS, IVÁN; SIANO, ALVARO SEBASTIAN

Santa Fe

Congreso; Encuentro de Jóvenes Investigadores; 2017

Universidad Nacional del Litoral

Péptidos y peptidomiméticos con actividad anticolinesterásicaSanchis, IvánLaboratorio de Péptidos Bioactivos ? Departamento de Química Orgánica ? Facultad deBioquímica y Ciencias Biológicas ? Universidad Nacional del LitoralINTRODUCCIÓNLa Enfermedadde Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia y afecta globalmente a 47,5millones de personas. La OMS la reconoce como una prioridad en salud pública. Patológicamente,se caracteriza por la formación de filamentos y placas seniles en el cerebro, cuyocomponente principal es el péptido beta-amiloide (Aß), que deriva de laproteólisis de la proteína precursora amiloidea (APP) (Carvajal y Inestrosa,2011). Sin embargo, según la denominada ?hipótesis colinérgica?, la pérdida delas funciones cognitivas en la EA se debe a una exacerbada actividad de lasenzimas colinesterasas (acetilcolinesterasa o AChE y butirilcolinesterasa oBChE), que catalizan la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina (ACh) encolina y ácido acético, causando un descenso de los niveles fisiológicos de ACh(Carvajal y Inestrosa, 2011). Por este motivo, la mayoría de las drogasdisponibles y en desarrollo para el tratamiento de la EA buscan inhibir laactividad de la AChE o BChE, para retrasar la inactivación de la ACh después desu liberación y favorecer su actividad estimuladora del sistema nervioso (Metahy col., 2012). De particular interés resultan, en este sentido, los inhibidoresllamados duales, capaces de inhibir ambas enzimas (Metah y col., 2012). Además,se conoce que las colinesterasas poseen dos sitios de unión: el sitio activo (CAS)responsable de la catálisis y el sitio aniónico periférico (PAS). Se hadescripto exhaustivamente cómo el sitio PAS de la AChE, por un lado, participadirectamente de la catálisis, y por el otro, es mediador de la reacción deagregación del péptido Aß, proceso en el cual esta enzima actúa como chaperona.Estas propiedades convierten a este sitio en un blanco molecular de graninterés para el tratamiento de la EA (Carvajal y Inestrosa, 2011). Algunospéptidos con capacidad anticolinesterásica se hallaron en venenos de animalesde especies poco relacionadas, como las fasciculinas I y II (FAS), inhibidoresduales del sitio PAS obtenidas de Dendroaspisangusticeps (mamba verde), y el péptido Hp-1971, aislado de la piel de Hysiboas pulchellus (rana del zarzal)(Siano y col., 2014). OBJETIVOS ·       Diseñar,sintetizar y evaluar nuevos péptidos y peptidomiméticos inhibidores de AChE yBChE tomando como modelo el péptido Hp-1971. ·               Analizar el mecanismo inhibitorio de los péptidos medianteensayos enzimáticos cinéticos y estudios de dockingflexible.·               Evaluar la citotoxicidad de los péptidos sintetizados.  METODOLOGÍASíntesis en fase sólida de lospéptidos (SPPS) con química Fmoc Se sintetizaron como amidas C-terminal usando una resina H-Rink Amida ChemMatrix. La desprotección del Fmoc se realizó con piperidina 20% en DMF, losacoplamientos con TBTU, HOBt y DIEA en DMF y el clivaje final con una mezclaTFA/H2O/TIS (95: 2,5: 2,5). Cada ciclo se evaluó cualitativamente conreacción de ninhidirina. Se sintetizaron análogos de las regiones 8-15 (SerieB) y 7-21 (Serie A) del Hp-1971, que mostraron tener capacidad inhibitoria (Siano ycol., 2014), sus secuencias se muestranen laTabla 1.Ensayo de punto final de actividad inhibitoria de BChE y AChEAmbos ensayos se basaron en la técnica de Ellman (Ellman y col., 1961), que consisteen la hidrólisis de butirilcolina/acetilcolina que genera butirato/acetato ycolina que, en presencia de DTNB, produce una reacción de color (lectura a 405 nm).La BChE se ensayó mediante un kit enzimático para determinación de colinesterasaWiener lab, a partir de suero humano y siguiendo el protocolo del fabricante.Para la AChE, se utilizó un micrométodo en el cual 0,25 U/mL de AChE comercialtipo VI-S de Electrophorus electricus(EEAChE) se incubaron por 30min con 0,24mM de yoduro de ACh, 0,2 mM de DTNB,0,04 mM de Na2PO4 y los péptidos, a pH 7,5 y transcurridoel tiempo se leyó la absorbancia a 405 nm. Para ambas enzimas lasconcentraciones finales de péptidos ensayadas fueron 50, 100 y 200 µM, losensayos se realizaron por duplicado frente a blancos de enzima y de muestra ycomo control positivo se utilizó galantamina. Evaluación de la citoxicidad - Ensayo de lisis deeritrocitos (hemólisis)Se ensayó la actividadlítica sobre glóbulos rojos humanos (GRh). Se incubaron 50, 100, 200 y 400 µMde péptido en 0,4% (v/v) de GRh en solución fisiológica en tubos Eppendorf (1h,37ºC) y se centrifugaron (1000xg, 5min). Alícuotas de sobrenadante setransfirieron a placas de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 405nm. El 0 y100% de hemólisis se determinaron en solución fisiológica y 1% de Triton-X100respectivamente. Los ensayos se realizaron por duplicado. Ensayo cinético de la inhibición del Hp-1971 de laenzima acetilcolinesterasa El ensayo se basó en latécnica de Ellman (Ellman y col., 1961). Se utilizó la EEAChE a 0,25 U/mLfinales. Como sustrato se utilizó yoduro de ACh a 0,96-0,03 mM con 0,2 mM deDTNB, Na2PO4 0,04 mM y con 0 (basal) y 100 µM de Hp-1971.El pH fue 7,5. La enzima se incubó con el inhibidor por 30min y se comenzó lalectura al adicionar el sustrato. Se midió la absorbancia a 405nm durante 2,28minutos cada 2 segundos (75 lecturas). Se ensayó por triplicado. Los resultadosse estudiaron mediante ajuste no lineal con las ecuaciones de Michaelis-Menten.Las variaciones de Vm y Km con y sin inhibidor, para determinar el tipo deinhibición, se compararon con un test de varianza para un factor y se consideróestadísticamente significativo un p<0,05.Estudios de dockingflexible de la AChESe utilizó un modelo deAChE obtenido del Protein Data Bank (PDB IE66) de Torpedo californica (tcAChE), de alta homología con la EEAChE y enla cual se determinaron los residuos de los sitios CAS y PAS. Se le removió elligando, las moléculas de agua y se le adicionaron hidrógenos polares. Loscálculos se realizaron con el programa HADDOCK con sus parámetros de default.Como residuos activos de AChE se seleccionaron los 3 aminoácidos del sitio CASy los 5 del sitio PAS (200, 440, 327 y 70, 72, 121, 279, 334, respectivamente).Los resultados se analizaron con el programa Discovery Studio Visualizer, quese utilizó también para preparar el modelo de tcAChE. El modelado molecular delpéptido se realizó con PEPFOLD3. Todos sus 21 residuos se seleccionaron comoactivos para el docking.RESULTADOSInhibición a punto final de AChE yBChE y hemólisisCon algunos péptidos seobtuvieron porcentajes de inhibición mayores que los de las secuenciasoriginales 8-15 y 7-21 (para BChE, 15 y 48% respectivamente y para AChE, 16 y24% respectivamente, a 200 µM). El péptido BS-G inhibió la BChE un58% más que el original y el AW-S un 50% más. Con respecto a la AChE, losporcentajes fueron en general menores; los que más inhibieron fueron el BA-S(25,4% a 200 µM) y el AF-G (18,5% a 200 µM). Los máshemolíticos fueron el BW-G y el BL-G (hemólisis de 62,55% y 56,61% a 400 µM)para la serie B y los AF-G y el AW-G para la serie A (100% de hemólisis a 400 µM).Estudio del tipo de inhibición mediante ensayo cinético y dockingLos resultados delensayo cinético se muestran en la Figura1. Se observa que la curva sigue el esquema de un inhibidor de tipo nocompetitivo. Además, se obtuvo una variación estadísticamente significativa dela Vm y no de la Km (ver resultados del test de varianza en Figura 2). Este resultado es acorde alobtenido con el docking, que muestranque el péptido interacciona con la región PAS de la enzima y no con el sitioactivo. El programa encontró 8 arreglos (clusters)y en la Figura 2 se muestra unarepresentación del que tuvo mejor puntaje HADDOCK (-102.1+/- -2.7). Con estadisposición, el inhibidor mostró interacción con 11 residuos: tyr70, val71,glu73, gln 74, phe 75, asp 276, trp 279, asp 285, leu 333, tyr 334, phe 339(los residuos tyr70, trp 279 y tyr 334 son tres de los cinco que componen elsitio PAS), la mayor parte de las interacciones fueron de tipo hidrofóbico. CONCLUSIONES La gran variedad de análogos generados permitió hallar modificaciones que mejoranla capacidad inhibitoria de la secuencia original. El análisis conjunto de losresultados del estudio cinético y los cálculos de docking, a su vez, permitió deducir que la inhibición se produce através de una interacción con el sitio aniónico periférico de la enzima, degran interés como diana terapéutica dada su participación en diversos procesosrelacionados con la patogénesis de la EA, como el proceso de agregación delpéptido beta-amiloide. Nuevos y futuros estudiosbuscarán sintetizar más análogos y caracterizar la inhibición de aquellos queresulten de interés, así como mejorar su estabilidad y biodisponibilidad.