INHIBIDORES PEPTÍDICOS DE ACETILCOLINESTERASA: MEJORAMIENTO DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA MEDIANTE DISEÑO RACIONAL

SANCHIS IVAN; AIMARETTI, FLORENCIA; SIANO, ALVARO

CIUDAD DE BUENOS AIRES

Congreso; XXXII CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA; 2019

ASOCIACION QUIMICA ARGENTINA

INHIBIDORES PEPTÍDICOS DE ACETILCOLINESTERASA: MEJORAMIENTO DE LA ACTIVIDAD INHIBITORIA MEDIANTE DISEÑO RACIONALSanchis, Iván1*; Spinelli, Roque1; Aimaretti, Florencia María1; Siano, Álvaro Sebastián11Laboratorio de Péptidos Bioactivos ? Departamento de Química Orgánica ? Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas (FBCB) ? Universidad Nacional del Litoral (UNL)*sanchisivan@fbcb.unl.edu.arIntroducciónLa acetilcolinesterasa (AChE, E.C. 3.1.1.7) es el blanco molecular más importante en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer (EA). Esta enzima participa tanto en la hidrólisis de acetilcolina mediante su sitio catalítico (CAS) como en la formación de las placas seniles mediante su sitio aniónico periférico (PAS). La inhibición del PAS, rico en residuos aromáticos, es considerada la estrategia más promisoria para el tratamiento (Pohanka, 2011). Algunos péptidos con actividad inhibitoria del PAS fueron aislados de pieles de anfibios. En este trabajo, se mejoró mediante diseño racional la actividad inhibitoria de LL, un análogo del péptido Hp-1935, secuencia aislada e identificada por nuestro grupo de trabajo del anuro argentino Boana pulchella (Siano y col., 2014). Se evaluaron, además, su actividad antioxidante, de interés por su efecto neuroprotector, y su actividad hemolítica, para estimar la toxicidad de los compuestos.MetodologíaTodos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis FMOC en fase sólida. La pureza de los productos se evaluó por RP-HPLC. La actividad inhibitoria se determinó mediante ensayo de Ellman, utilizando AChE comercial de Electrophorus electricus. Se calculó la concentración requerida para lograr el 50% de inhibición (CI50), con el paquete GRmetrics del programa R.El sitio de acción y mecanismo inhibitorio del LL se determinó mediante estudios cinéticos y simulaciones de docking flexible con el software HADDOCK (Bonvin y col., 2016).Utilizando la mejor configuración del complejo enzima-inhibidor del docking, se realizó una simulación de dinámica molecular (DM) para luego calcular el espectro de interacción por residuo mediante descomposición de la energía libre teórica, para evaluar la contribución de cada aminoácido al efecto inhibitorio, con el método MM-GBSA y el paquete Amber18. Previo a la corrida de producción de 10 ns, el sistema fue sometido a dos minimizaciones energéticas para optimizar la orientación del solvente, una termalización para elevar la temperatura a 300K y 1ns de equilibración para lograr una correcta densidad. Se utilizó el algoritmo SHAKE para emplear un paso de tiempo de 2fs.A partir de los resultados y con el objetivo de aumentar la actividad inhibitoria, se diseñaron 8 análogos de sustitución con residuos aromáticos, teniendo en cuenta que la mayoría de los inhibidores del PAS contienen anillos aromáticos o heteroaromáticos y actúan mediante contactos de π-stacking,Para estudiar la actividad antioxidante de los péptidos se utilizó el ensayo del DPPH y para la actividad hemolítica el ensayo de lisis de glóbulos rojos humanos (GRh).ResultadosEl sitio de acción de LL es el PAS, según indican los estudios de docking y corroboran los ensayos cinéticos, que muestran un mecanismo inhibitorio no competitivo. Analizando las trayectorias de DM y la descomposición por residuo, se encontró que una prolina en posición 3 es el residuo que más contribuye al efecto inhibitorio, interaccionando con residuos clave del PAS mediante contactos alquil-aromático. Dado esto, se decidió sustituir la prolina por aminoácidos aromáticos para potenciar la interacción, estableciendo contactos de tipo aromático-aromático.Se sintetizaron 8 nuevos análogos introduciendo Tyr, Trp, Phe y 4-Fluoro-Phe. En tres, se introdujeron dos aromáticos: en lugar de la prolina y en posición 7, a una distancia suficiente para evitar la interacción intramolecular entre las cadenas laterales.Comparando los valores de CI50 de los análogos y el LL, se ve que ciertas modificaciones aumentan contundentemente la actividad inhibitoria y otras la reducen. El LL presentó una CI50 de 369,13µM (286,65-451,61), valor que se redujo hasta 11,99µM (10,75-13,23) al sustituir la prolina por triptófano en el análogo más activo, logrando un incremento mayor a 30 veces en la inhibición. El segundo análogo más activo fue el que contiene dos triptófanos, con una CI50 de 56,53 µM (54,00-59,06).Los cambios que redujeron la actividad fueron la introducción de Tyr, Phe o 4-fluoro-Phe, que llevaron la CI50 a valores superiores a 1000µM. La introducción de Trp sólo en posición 7 generó un aumento en la inhibición mucho más leve, indicando que esa región de la secuencia no sería la principal para el efecto inhibitorio.La actividad antioxidante también tuvo importantes diferencias entre el LL y los análogos. La introducción de aromáticos incrementó esta actividad. El análogo más activo fue el que tiene dos Trp, que generó una neutralización de radicales DPPH de 87,46% a 200µM. Para el análogo con mayor actividad inhibitoria el valor fue 76,86%. En ambos casos se incrementó ampliamente el 21,73% alcanzado por el LL a esa concentración. En la hemólisis, sólo dos análogos, que contienen dos residuos aromáticos, mostraron actividad hemolítica considerable a las concentraciones ensayadas (200-25 µM). Los porcentajes variaron entre 19,01% y 98,51%. El análogo de mayor actividad inhibitoria se mostró moderadamente hemolítico sólo a partir de 100µM, con un porcentaje de 21,86%.ConclusionesLa estrategia implementada para potenciar la actividad inhibitoria del péptido LL resultó efectiva. La introducción de Trp a la secuencia en lugar del residuo de mayor energía de interacción predicha por la simulación de DM, produjo un aumento de más de 30 veces en el valor de CI50. La actividad de este análogo lo posiciona entre los péptidos de aminoácidos naturales con mayor acción inhibitoria de AChE reportados, lo que lo convierte en una excelente secuencia de base para el diseño de fármacos en el tratamiento de la EA, considerando además su baja actividad hemolítica, su elevada actividad antioxidante y el hecho que actúa en el sitio PAS de la enzima, principal blanco molecular en el desarrollo de nuevos fármacos. Futuros estudios buscarán entender mejor las características del compuesto, como su actividad inhibitoria sobre AChE humana y su citotoxicidad.ReferenciasPohanka, 2011. Cholinesterases, a Target of Pharmacology and Toxicology. BiomedPapMedFacUnivPalackyOlomoucCzechRepub, 2011Sep;155(3):219?230.Siano y col., 2014. Antimicrobial Peptides from Skin Secretions of Hypsiboas Pulchellus (anura: Hylidae). JNatProd, v.77,.4 pp.831-841.Bonvin y col., 2016. The HADDOCK2.2 webserver: User-friendly integrative modeling of biomolecular complexes. JMolBiol, 428,720-725.