Estatregias para la producción de bioplásticos a partir de recursos naturales renovables

FRESCURA, JULIETA M; ROJAS, NATALIA L; GHIRINGHELLI, PABLO D

San Miguel de Tucuman

Simposio; Simposio argentino de bioprocesos (SAPROBIO); 2018

ResumenEl presente trabajo se encuentra enmarcado en un proyecto que se enfoca en generar una plataforma de producción de poli 3-hidroxipropionato (p(3HP)), un bioplástico con propiedades físicas y mecánicas prometedoras. Mediante la integración de disciplinas como la bioinformática, ingeniería genética y bioprocesos, se pretende producir este tipo de plástico alternativo. Se propone seleccionar residuos agroindustriales adecuados como fuente de carbono y energía para su producción analizando la viabilidad económica y su disponibilidad en la región. Así, este trabajo se basa en el diseño de la estrategia y construcciones iniciales para obtener los microorganismos recombinantes productores del biomaterial, comenzando con las manipulaciones genéticas y la combinación de metodologías y recursos que llevaron a la obtención de los primeros resultados en el tema.Palabras claveBiorrefinería; Poli 3-hidroxipropionato; Glicerol crudo; Pichia pastoris.1. IntroducciónLos plásticos convencionales presentan una problemática ambiental debido a su no biodegradabilidad, al alto consumo de energía y emisión de CO2 en su producción y a que alrededor del 40% del plástico producido se desecha en los vertederos [Naranjo Vasco, 2010].Una alternativa son los polihidroxialcanoatos (PHAs), tal como el p(3HP) que presenta una buena combinación de propiedades mecánicas: alta resistencia a la tracción, de alargamiento a la ruptura y aceptable módulo de elasticidad. Si bien hasta el momento no se han encontrado organismos capaces de producirlo de forma natural, se han desarrollado diferentes rutas para su síntesis, destacándose la ruta de propionaldehído deshidrogenasa (pduP) [Wang et al., 2013]. El objetivo general de este trabajo es desarrollar estrategias alternativas para la obtención de p(3HP) a partir de materias primas renovables, mediante la combinación de herramientas de ingeniería genética y técnicas de diseño de bioprocesos, con el fin de obtener microorganismos capaces de generar bioplásticos de uso frecuente en procesos económicamente viables.2. MetodologíaPara el diseño in silico de la estrategia se hizo uso de diversos software, entre ellos: Blast (Basic Local Alignment Search Tool) para la búsqueda y selección de secuencias, JCat (Java Codon Adaptation Tool) para la optimización de codones, y Clone Manager Professional 9.2 (Scientific & Educational Software) para evaluar las reacciones de digestión, ligación y PCR. Las etapas de clonado molecular se llevaron a cabo mediante protocolos estándar y siguiendo en todos los casos las recomendaciones de los fabricantes (New England Biolabs, EEUU; Promega, EEUU; Fermentas, EEUU; PB-L, Argentina). Todas las purificaciones de DNA plasmídico se realizaron mediante la técnica de miniprep. La cepa de Escherichia coli empleada en las etapas de clonado molecular fue Top10 (Invitrogen, EEUU). Los cultivos bacterianos se realizaron en medio LB (Luria-Bertani) en presencia de ampicilina 100 µg/ml o kanamicina 50 µg/ml (Sigma Aldrich, EEUU) según el caso particular. Las reacciones de secuenciación se realizaron mediante el procedimiento automático de Sanger (Macrogen, Seoul, República de Corea).3. Resultados y discusiónLa estrategia planteada para que el proceso resulte competitivo tanto desde el punto de vista ambiental como tecnológico y económico es la integración del proceso a una biorrefinería de glicerol crudo, una fuente renovable y con costo muy bajo o nulo. Se utilizó la ruta metabólica propuesta previamente por Wang et al., que consta de cuatro enzimas (DhaB, Gdr, PduP y PhaC), y suma un total de siete subunidades codificadas por genes individuales (dhaB1, dhaB2, dhaB3, gdrA, gdrB, pduP y phaC1).Dado que el sustrato mencionado puede contener trazas de contaminantes, como el metanol, se realizó el diseño optimizado para la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Considerando la integración en el genoma de P. pastoris, se optó por expresar todas las subunidades correspondientes a las enzimas de la ruta biosintética a partir de un único gen. De esta manera, se diseñó una poliproteína (Figura 1) que consiste en todos los ORF correspondientes a las subunidades antes mencionadas sin codones de stop e intercaladas con diferentes secuencias codificantes para el péptido auto-procesable T2A [Geier et al., 2015]. Las secuencias correspondientes a los ORF de las proteínas originales fueron optimizadas con el programa JCat para Saccharomyces cerevisiae, ya que presenta una frecuencia de uso de codones similar a P. pastoris.Compuesta por las secuencias individuales de las siete subunidades que componen enzimas involucradas en la ruta metabólica (morado) y las secuencias codificantes para el péptido auto-procesable 2A (negro). La secuencia nucleotídica codificante para la poliproteína fue sintetizada químicamente por Biomatik Corporation (Cambridge, Canadá), en cinco fragmentos delimitados por los sitios de clivaje de las enzimas de restricción NdeI, BamHI, SalI, AgeI, KpnI y PstI que permiten el correcto ensamblado del ORF de la poliproteína, y en consecuencia dan nombre a cada fragmento en base a sus extremos (N-B, B-S, S-A, A-K, K-P). Los sitios para las endonucleasas se diseñaron de manera que fueran únicos dentro de la secuencia, al mismo tiempo que los cambios nucleotídicos necesarios para su generación representaran mutaciones silenciosas. Además, se diseñó un sitio de clonado múltiple (MCS) que presentara los sitios de las enzimas a utilizar en el ensamblado, en el orden dispuesto dentro de la secuencia codificante para la poliproteína. Dicho MCS contiene en sus extremos secuencias de reconocimiento para la endonucleasa EcoRV, lo cual permite generar extremos compatibles para el clonado dentro del vector pBSK simple kanamicina.En base a los fragmentos sintéticos, se planteó una secuencia de 7 etapas para el ensamblado de la construcción final codificante de la poliproteína diseñada. En la primer etapa se obtuvo el vector base pBSK MCS-DGAVI mediante el clonado del MCS diseñado en pBSK simple kanamicina. En la segunda etapa se clonó el primer fragmento (N-B), construcción denominada pBSK MCS-DGAVI_f1, y en el tercer paso se ensambló el segundo fragmento (B-S), generando pBSK MCS-DGAVI_f12.4. ConclusionesMediante la combinación de estrategias de ingeniería genética y bioprocesos fue posible diseñar un sistema para la producción de un bioplástico en un proceso económicamente viable. En base a los resultados obtenidos se continuará con las siguientes etapas de ensamblaje del ORF de la poliproteína, para obtener una cepa de P. pastoris recombinante productora de p(3HP). 5. BibliografíaGeier M., Fauland P., Vogl T., Glieder A. (2015). Compact multi-enzyme pathways in P. pastoris. Chemical Communications 51, 1643-1646.Naranjo Vasco, J.M. (2010). Producción de polihidroxibutirato a partir de residuos agroindustriales. Tesis para optar por el título de Magister en Ingeniería Ingeniería Química Grupo de Investigacion de Procesos Químicos, catalíticos y Biotecnológicos Universidad Nacional de Colombia, Sede Manizales.Wang, Q.; Yang, P.; Liu, C.; Xue; Y.;Xian, M.; Zhao, G. (2013). Biosynthesis of poly(3-hydroxypropionate) from glycerol by recombinant Escherichia coli. Bioresource Technology, 131:548?551.