Generación y Caracterización de mutantes DesK de Bacillus subtilis que se autofosforilen en distintos rangos de temperatura

TORRESI, FLORENCIA; DE MENDOZA, DIEGO; MANSILLA, MARÍA CECILIA

Rosario

Jornada; XI Jornada de Ciencia y Tecnología; 2017

Universidad Nacional de Rosario

El mecanismo de adaptación al frío mejor caracterizado hasta el momento en bacterias es el circuito Des de B. subtilis. Esta vía regula la expresión del gen des que codifica para la ∆5-desaturasa y responde a un descenso en la fluidez de membrana. Está regulada por un sistema de transducción de señales de dos componentes, constituido por una quinasa integral de membrana, DesK, y un regulador de respuesta soluble, DesR. DesK es una histidina quinasa con un dominio sensor N-terminal, compuesto por 5 segmentos transmembrana (residuos 1 a 153) y un dominio catalítico citoplasmático C-terminal, denominado DesKC (residuos 154 a 370). DesK tiene actividades quinasa, fosfatasa yfosfotransferasa. En la estructura cristalográfica de DesKC en el estado fosfatasa se reconoce un motivo coiled-coil (2-HCC) que no se observa en la conformación auto-quinasa. El modelo actual de transmisión de señal sugiere que la formación reversible del 2-HCC regula el balance de las actividades fosfatasa y auto-quinasa de DesK. Así, a 37°C, cuando la membrana se encuentra en estado fluido, DesK puede formar el coiled-coil estable y se encuentra en estado fosfatasa dominante y cuando disminuye la temperatura a 25°C, la membrana pierde fluidez, el dominio coiled-coil se desestabiliza y DesK adquiere un estado auto-quinasa.Con el objetivo de generar un termosensor bacteriano capaz de adoptar un estado auto-quinasa a temperaturas más bajas, se realizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida en la zona del 2-HCC de DesK, tratando de generar un coiled-coil más estable pero capaz de responder a una señal de frío más intensa. Mediante overlap-PCR se introdujeron residuos hidrofóbicos en posiciones clave en la interacción entre las hélices (R157I, S153L-R157I, S150I, S122I-S150I, 157I-L174P y S122I). Para evaluar la actividad quinasa de las mismas se expresó cada una de las variantes bajo un promotor inducible por xilosa (Pxyl) en la cepa DAK3 de B. subtilis, la cual es nula en DesK (desK - ) y contiene una fusión transcripcional del promotor de la desaturasa al gen lacZ (Pdes-lacZ) en el locus amyE. Para evaluar la actividad fosfatasa las variantes fueron expresadas en la cepa AKP20 (desKR - Pkan-desR Pdes-lacZ), que expresa altas concentraciones del regulador DesR. Los resultados de las medidas de actividad β-galactosidasa en estas cepas mostraron que la expresión de las variantes DesKR157I y DesKS153L-R157I no presentaron actividad autoquinasa a 25°C, 20°C o 15°C, y se comprobó que ambas manifiestan actividad fosfatasa dominante. Las actividades auto-quinasa y fosfatasa de las otras cuatro variantes están en proceso de evaluación.En este trabajo se pudo demostrar que la introducción de un solo residuo hidrofóbico (Isoleucina), en la posición 157 de DesK permite estabilizar el coiled-coil, de manera tal que se favorece la actividad fosfatasa de DesK, impidiendo toda actividad auto-quinasa aún a muy bajas temperaturas.