DESARROLLO DE UN PLÁSMIDO RECOMBINANTE PARA SER UTILIZADO COMO HERRAMIENTA PARA DETECTAR MUTACIONES TRUNCANTES

REAL SEBASTIAN; GOMES LAURA; MAYORGA LUIS; ROQUÉ MARÍA

Mar del Plata

Congreso; Congreso anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2004

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Un sistema doble híbrido bacteriano se basa en la complementación funcional de dos fragmentos de una enzima, la cuál produce un segundo mensajero necesario para la transcripción de ciertos genes, como el reportero ß-Galactosidasa. Estos fragmentos al ser expresados por separado son no funcionales. Sin embargo, si son fusionados sus cDNA en un vector, esta unión resulta también en una enzima activa y por lo tanto en la expresión de genes. Nuestra hipótesis es que insertando una secuencia de ADN entre ambos fragmentos, la presencia de un codón «stop» en esta, daría un solo fragmento no funcional; y en caso de ocurrir un evento de re-iniciación río abajo del codón «stop», se obtendrían dos fragmentos, pero separados y por lo tanto tampoco funcionales. Al transformar bacterias carentes de esta enzima, se podría medir la presencia de un codón stop en la secuencia insertada por la expresión del gen reportero ß-Gal. Nuestro objetivo fue diseñar y desarrollar este plásmido recombinante, y confirmar su reconstitución funcional a través de la observación de distintos fenotipos del reportero ß-Gal. Para esto se insertó uno de los fragmentos del gen de la enzima (se evita mencionar la enzima por posible patentamiento del método), en marco de lectura y separado por un MCS, dentro del plásmido que contenía el otro fragmento de la enzima, y posteriormente se transformaron bacterias carentes de esta enzima endógena. Se obtuvieron colonias de color azul (en presencia de X-Gal) en las bacterias transformadas, mientras que las células control (sin transformar) fueron de color blanco. Concluimos que el plásmido diseñado es funcional y revierte el fenotipo de las bacterias, y de esta manera se plantea su posible uso como herramienta para diagnóstico de mutaciones truncantes.