Diseño de una PCR-Metilación específica para analizar el patrón de metilación del promotor de la fosfotirosina fosfatasa SHP-1 en tejido epitelial.

CARIAGA-MARTINEZ AE; CUBILLA MA; LORENZATI MA; RODRÍGUEZ DI; ZAPATA PD.

Jonville, Brasil

Congreso; FARMAPOLIS 13 edición, XI Congreso Catarinense de Farmacéuticos y Bioquímicos, 27 al 30 de octubre de 2005.; 2005

FARMAPOLIS

Es bien conocido que la hipermetilación de regiones promotoras lleva a la disminución en la expresión génica. Mediante el desarrollo de una nueva técnica, que combina la especificidad de la reacción de PCR con la posibilidad de analizar islas CpG, es posible monitorear el patrón de metilación de genes y promotores génicos. La técnica de MSP se basa en el tratamiento del DNA con bisulfito de sodio, lo que provocará la desaminación de las citosinas no metiladas, generando uracilo. Todas aquellas citosinas que estén metiladas serán resistentes al tratamiento con bisulfito, por lo cual podremos discriminar el patrón de metilación de la región estudiada variando la secuencia de los primers, según la metilación o no de las citosinas presentes en la secuencia del promotor de la fosfotirosina fosfatasa SHP-1. El paso crucial para poder aplicar la MSP a los especimenes estudiados es diseñar los primers utilizando herramientas de bioinformática. Para ello se utilizarán las herramientas disponibles en la base de datos del NCBI, accediéndose a la estructura completa del gen SHP-1 a través de la clave de acceso AH003242. La fosfotirosina fosfatasa SHP-1 consta de dos promotores, cuya actividad es diferencial de acuerdo a los linajes celulares. El promotor 1 actúa exclusivamente en la regulación génica de la SHP-1 en células no hematopoyéticas, por lo que será la región que utilizaremos en adelante. El promotor 2 de la SHP-1 se encarga de regular la expresión de la proteína en linajes hematopoyéticos. Se trabaja con el promotor 1 de SHP-1, a partir del número de acceso de secuencia de GenBank U15537 (1200 pb DNA lineal), que además incluye al exón 1 y la región 5?-UTR. (promotor 1?986; 5?-UTR: 987?1135; exón 1: 987..1149; intrón 1: 1150?.1200). Se obtiene además la clave de la secuencia completa de la región 12p13  donde mapea SHP-1 (clave de acceso de GenBank U47924), con motivo de ser analizada y utilizada en proyectos posteriores. Diseño de primers: Se diseñan los primers partiendo de la hipótesis de que todas las citosinas ubicadas en 5? a una guanina se encuentran metiladas. Se requiere un trabajo manual para desarrollar los primers, no utilizando protocolos de bioinformática. Una vez desarrollados los primers se calculan las Tm utilizando la aproximación termodinámica de entalpía y entropía (?nearing neighbour?) y se procede a compararlas con las obtenidas a partir de programas de diseño. Amplificación por PCR: la estrategia se basa en una ASO MS PCR. Se modificará con bisulfito la muestra de DNA y luego se utilizará un primer 3? común (PTPN6-3?Com) y primers 5? específicos para distinguir los alelos metilados (PTPN6-5?Met) y los no metilados(PTPN6-5?NMet). El primer PTPN6-5?Met fue diseñado de modo tal que incluya citosinas metiladas (según la hipótesis de partida), que hibridarán en el caso de que el alelo analizado se encuentre metilado. El primer PTPN6-5?NMet se diseñó cambiando todas las citosinas por timinas, permitiendo entonces que hibride en el caso de que el alelo investigado se encuentre no metilado. Además, se utilizará un tercer primer 5? (PTPN6-5?Ctrl), que hibridará en una zona interior, compartiendo también el primer PTPN6-3?Com, y cuyo producto servirá como control interno positivo, para asegurar que la reacción de PCR ha sido exitosa, descartando de ese modo la posibilidad de que la ausencia de productos de amplificación se pueda deber a una falla en la PCR y no a una variación verdadera en el patrón de metilación. Los productos de amplificación son resueltos utilizando geles de agarosa y geles de poliacrilamida.