Análisis por SSCP de cepas del virus Junín con distinto patrón clínico

D. M. POSIK, P. D. GHIRINGHELLI, C. G. ALBARIÑO, M. E. LOZANO Y V. ROMANOWSKI.

Mendoza, Argentina

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular; 1998

El virus Junín, agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), pertenece a la familia Arenaviridae. Los miembros de esta familia son virus envueltos cuyo genoma está compuesto por dos moléculas de RNA de simple cadena denominadas S (small) y L (large). El RNA S contiene los marcos de lectura de las proteínas N (nucleocápside) y GPC (precursor de las glicoproteínas). Sistemáticamente, los casos de FHA pueden clasificarse en comunes o leves, hemorrágicos, neurológicos o mixtos. Para analizar las bases moleculares de los diferentes síndromes de la enfermedad, se seleccionaron cepas prototipo del virus Junín (Espíndola, Romero y Ledesma) asociadas a estas formas clínicas de FHA. A partir del RNA total de células infectadas con cada una de las cepas, se sintetizó el cDNA y se secuenció la región correspondiente al gen GPC. En base al análisis computacional comparativo de las cepas del virus Junín con información molecular disponible, se seleccionó la región del gen GPC que presenta el mayor número de cambios, tanto a nivel de las secuencias nucleotídicas como aminoacídicas. Como criterios adicionales de selección, se realizaron análisis predictivos de la estructura secundaria de las distintas GPCs y, también, del plegamiento intracatenario del RNA viral en la región seleccionada. Además, se estudió la influencia de la temperatura sobre los confórmeros nucleotídicos predichos. De esta manera se eligió un rango de temperaturas óptimas para SSCP (single strand conformation polymorphism). Utilizando RNA total de las cepas prototipo y la cepa MC2 como control, se efectuó una RT-PCR para amplificar los fragmentos correspondientes a la región genómica escogida. Los distintos fragmentos de PCR fueron desnaturalizados y sometidos a electroforesis en un gel nativo de poliacrilamida a temperatura constante (según las condiciones predichas), visualizándolos mediante tinción con plata. Los confórmeros correspondientes a ambas hebras de cada fragmento de PCR muestran patrones de migración sustancialmente diferentes para las distintas cepas analizadas. Estos resultados, demuestran la utilidad de la metodología para analizar rápidamente un gran número de muestras de pacientes en programas de epidemiología molecular. De esta manera, se podría seleccionar un conjunto de las mismas para efectuar un análisis molecular más detallado por secuenciamiento nucleotídico.