Método combinado de extracción de ADN genómico a partir de semen bovino.

BRIGNONE SG; MENA CJ; GARRO A; CHIAPPELO LS; RAVETTI S; PALMA SD

Congreso; LII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Farmacología Experimental (AAFE 2020).; 2020

Tanto los estudios genómicos como los epigenómicos del ADN espermático constituyen una herramienta fundamental para las investigaciones biológicas, la ingeniería genética y la práctica reproductiva clínica.La extracción de ADN a partir de semen presenta desafíos únicos (debido a una barrera rica en enlaces disulfuro y una compactación de la cromatina del espermatozoide) en comparación con la extracción de ADN de las células somáticas. La idiosincrasia de estas células haploides hace necesario el uso de métodos no convencionales de extracción de ADN.El objetivo de este trabajo radicó en combinar un protocolo específico de extracción de ADN de esperma de mamíferos (protocolo original (PO)- Weyrich, A. (2012)) junto a un protocolo basado en columnas comerciales (DNeasy Blood & Tissue Kits - QIAGEN), con la intención de obtener material genético de alta calidad (óptimo rendimiento, pureza aceptable y adecuada integridad del ADN).Para realizar la extracción se utilizó pajuelas criopreservadas de semen bovino de la empresa ABS Argentina. Todo el proceso se realizó bajo esterilidad.La muestra de semen fue sometida, en primer lugar, a un proceso de centrifugación, el cual permitió eliminar el fluido seminal. El pellet de células obtenido se lavó con buffer salino (Phosphate-buffered saline-PBS). Posteriormente, las células fueron sometidas a un proceso de lisis, en el cual se utilizaron concentraciones mayores de tritón-X100, ditiotreitol (DTT) y proteinasa K comparadas con las usadas en el PO. La mezcla fue incubada durante una noche a 50°C. Por último, para la purificación y precipitación del ADN se utilizó el Kit QIAGEN.La calidad y concentración del ADN extraído se determinó mediante espectrofotometría con luz UV. Por otro lado, la integridad del ADN fue evaluada a partir de geles de agarosa. Se realizó también reacciones en cadena de la polimerasa (PCR).En comparación con el PO, los resultados obtenidos a partir del método combinado fueron más prometedores. La concentración de ADN= (PO):112ng/µL-no confiable debido a la presencia de compuestos aromáticos; (método combinado):8,98 ng/µL; relación 260/280 nm= (PO) 1,6.En conclusión, este método combinado de extracción de ADN puede ser utilizado de forma independiente o como parte de un flujo de trabajo continuo adaptado ya que permite obtener material genético de adecuada calidad.