CONDICIONES CRÍTICAS EN LA DETERMINACIÓN DEL COMPLEMENTO ACTIVADO C5B-9 PARA SU USO COMO HERRAMIENTA DE DIAGNÓSTICO Y MONITOREO DE PACIENTES CON MICROANGIOPATÍA TROMBÓTICA (MAT)

CÉLIA DOS SANTOS; MARÍA F ALBERTO; JUVENAL PAIVA; MARÍA M CASINELLI; MARÍA A LAZZARI; ANA C KEMPFER; ANALÍA SÁNCHEZ-LUCEROS

Congreso; SAH 2015-XXII CONGRESO ARGENTINO DE HEMATOLOGIA; 2015

IntroducciónEl Síndrome Urémico Hemolítico atípico (SUHa) y la Púrpura Trombótica Trombocitopénica (PTT) son MATs caracterizadas por anemia hemolítica no inmune y trombocitopenia. El diagnóstico diferencial entre ellas es difícil incluso si el SUHa es consecuencia de la dis-regulación del complemento y la PTT del déficit de función de ADAMTS13. Datos recientes (Cataland y col., 2014) describen niveles de C5a y C5b-9 más altos en pacientes con SUHa que en PTT, sugiriendo un rol para distinguir ambas.ObjetivosEvaluar los pasos y las condiciones críticas para el análisis de C5b-9 en plasma de donantes sanos e identificar los problemas inherentes al método.Material y métodos1- Anticoagulante: recolección de sangre de 3 donantes sanos (D1, D2, D3) en EDTA 1,5 mg/mL o citrato de sodio 3,13%.2- Centrifugación con trasvasamiento a distinto tubo: (i) 2x 1000g/10min/4ºC (ii) 1x 1000g/10min/4ºC seguido con 1x 12000g/2min/4ºC (Yang y col., 2015).3- Almacenamiento post-extracción (sangre): 0h, 24h y 48h (4ºC).4- Procesamiento post-centrifugación (plasma): inmediato, ulterior (plasma congelado a -70ºC).5- Temperatura de descongelación del plasma: 37ºC, temperatura ambiente, 4ºC.La concentración de C5b-9 se determinó por ELISA (BD OptEIA, human C5-9 ELISA set, BD Biosciences).Resultados1- No hubo diferencias significativas de los niveles de C5b-9 entre las muestras EDTA y citrato de sodio (p=0.18) procesadas inmediatamente. Se observaron mayores niveles de C5b-9 (p<0.05) en las muestras citrato comparado a las muestras EDTA congeladas. Por lo que se trabajó con EDTA en los pasos siguientes.2- La concentración de C5b-9 aumentó de 33-56% en muestras procesadas (i) vs. (ii) (D1: 374,4 vs 239,6 ng/mL; D2: 941,3 vs 692,5 ng/mL, D3: 497,4 vs 372,1 ng/mL).3-La concentración de C5b-9 en el plasma de D2 y D3 permaneció estable en sangre almacenada hasta 24h.4 y 5- D1 descongelado a 37ºC y a temperatura ambiente mostró activación de C5b-9 de 128% (p<0.001) y 100% (p<0.05) respectivamente. La temperatura óptima de descongelación fue 4ºC, no observando diferencias de C5b-9 comparado a la muestra no congelada (237,2 vs 273,4 ng/mL).Como paso final, se agregó Tween 0,05% al tampón de dilución, comprobando una disminución del 30% de la concentración de C5b-9 por eliminar su unión inespecífica.ConclusionesLos resultados indican que en la evaluación del complemento C5b-9 se deben seguir exactamente las condiciones elegidas para obtener valores válidos y reproducibles. Las condiciones críticas son: extraer la sangre con EDTA o citrato de sodio para un procesamiento inmediato o con EDTA en caso de congelar el plasma; procesar la muestra con EDTA dentro de las 24h de almacenada a 4ºC; utilizar dos centrifugaciones refrigeradas (la última eliminaría interferentes-plaquetas); y descongelar el plasma a 4ºC con agitación en el momento del procesamiento. Con estas precauciones, los resultados obtenidos en pacientes con MAT en fase aguda permitirán valorar el rol de C5b-9 en el diagnóstico y monitoreo de estas enfermedades.