CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ACTIVIDAD DE LYSA DEL BACTERIÓFAGO TM4

FLORENCIA PAYASLIAN; URDÁNIZ, ESTEFANÍA; MARTÍN, MARIANO; PIURI, MARIANA

José C. Paz

Congreso; II Jornadas Latinoamericanas de Bacteriófagos; 2022

TM4 es un bacteriófago que infecta micobacterias, incluidas M. tuberculosis y M. smegmatis, entre otras. En su genoma, se identificó el casete que codifica para la maquinaria lítica de dicho fago, compuesta por las proteínas LysA, LysB y holina, codificadas putativamete por los loci gp29, gp30 y gp31, respectivamenteA través del análisis bioinformático pudimos establecer que LysA consta de 3 módulos; un dominio C-terminal que probablemente se une a la pared celular, un dominio central con gran similitud con una amidasa-2 y un dominio N-terminal propuesto para codificar una peptidasa. El sitio catalítico del dominio amidasa se compone de tres residuos que coordinan un catión Zn - His226, His335 y Asp347 – y Glu290, residuo encargado de coordinar una molécula de agua.Para poder evaluar el rol de cada uno de estos aminoácidos en la actividad de la proteína, se construyeron cuatro derivados de la proteína que contenían las siguientes mutaciones en cada uno de estos residuos clave: H226S, H335S, D347N y E290Q.Las fracciones purificadas de LysA se incubaron con MDP, una molécula sintética que emula los enlaces del peptidoglicano. Los productos de la reacción se analizaron por HPLC-MS y se detectaron ácido N-acetil-murámico y dipéptido L-Ala-D-isoGlutamina, lo que confirma que LysA tiene una actividad amidasa, como se predijo in silico.También evaluamos la capacidad de LysA para lisar E. coli o M. smegmatis desde adentro, monitoreando la densidad óptica de cultivos transformados con un plásmido que expresa LysA WT o cada una de las mutantes. Hubo una disminución significativa en la densidad óptica de los cultivos que expresaban la versión LysA WT pero no se observó lisis en ninguno de los mutantes. Estos resultados indican que los cuatro residuos previstos son esenciales para la función de la proteína in vitro tanto cuando se expresan en un huésped homólogo o heterólogo.Por medio de la técnica de BRED generamos fagos derivados de TM4 que portaban las mutaciones E290Q o H266S. Curiosamente, no se encontraron diferencias en la eficiencia de la siembra entre las versiones mutadas del fago y el WT. Esto podría indicar que estas mutaciones no son suficientes para anular la lisis in vivo o que un gen críptico de endolisina está codificado en el genoma de TM4.