Purificación de lacasa de origen fúngico por adsorción en matrices de polielectrolitos.

EVA CAROLINA ARRUA; NATALIA MONTELLANO DURÁN; MARIA PAULA MORELLI; BEATRIZ FARRUGGIA; DARÍO SPELZINI

Corrientes

Jornada; XXI Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades del Grupo Montevideo; 2013

PURIFICACIÓN DE LACASA DE ORIGEN FÚNGICO POR ADSORCIÓN EN MATRICES DE POLIELECTROLITOSEVA CAROLINA ARRÚA1NATALIA MONTELLANO DURÁN2BEATRIZ FARRUGGIA3MARÍA PAULA MORELLI4DARIO SPELZINI5Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Universidad Nacional de Rosario.Laboratorio de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación.Rosario, Argentinaarruacarolina@gmail.com1, gwen_nd@msn.com2, bfarrug@gmail.com3, paula.morelli@hotmail.es4, dario.spelzini@conicet.gov.ar5Actualmente existen muchas fuentes de contaminación de aguas y suelos. En nuestra región el impacto ambiental que poseen las papeleras y la industria agrícola es preocupante. Algunos de los compuestos producidos por incineración de diversos materiales como combustibles fósiles, maderas o residuos son los hidrocarburos aromáticos policíclicos , esto es asíque se generan cuando la combustión es incompleta. Además en las industrias papeleras, durante el proceso de blanqueado de la pasta de celulosa se producen una mezcla compleja de fenoles clorados y compuestos clorados poliméricos de lignina que son responsables de la naturaleza turbia de los efluentes. Tanto estos compuestos clorados como los hidrocarburos aromáticos policíclicos son ubicuos y altamente contaminantes ejerciendo efectos tumorigénicos, carcinogénicos y mutagénicos al unirse a grupos nucleofílicos del ADN, el ARN y las proteínas. Los hongos junto a las bacteriasfilamentosos juegan un rol importante en la degradación de materiales orgánicos en los ecosistemas y tienen el potencial de remediar suelos y cursos de agua contaminados. Se han usado distintas bacterias para la degradación de compuestos contaminantes, sin embargo la utilización de hongos de la podredumbre blanca resulta más apropiada debido a que, gracias a sus enzimas capaces de degradar lignina pueden también degradar un amplio espectro de compuestos contaminantes. Entre las especies de hongos que tienen esta capacidad se encuentran los basidomicetos Trametes versicolor que producen como parte de su sistema lignolítico, lacasa. La lacasa, (E.C. 1.10.3.2) una p-benzenodiol: oxígeno óxido reductasa. Estas enzimas extracelulares pueden oxidar hidrocarburos aromáticos policíclicos. La lacasa está involucrada en la biodegradación de la lignina y en la renovación de los ácidos húmicos. La lacasa de Trametes versicolor ha sido aplicada en procesos de biorremediado para la degradación química de hidrocarburos aromáticos policíclicos; para procesos industriales como el lavado de telas en la industria textil y también ha sido empleada en la industria alimenticia para la remoción de fenoles de jugos de frutas, cerveza y vino. La lacasa es una enzima extracelular, es decir, que el hongo la excreta al medio de cultivo durante su crecimiento. De esta manera aAl cultivar el hongo, se obtiene una mezcla compleja que contiene la enzima de interés. Para poder ser utilizada en biorremediado es necesario recuperar a la lacasa del medio en el que se encuentra. El objetivo de este trabajo fue purificar lacasa a partir de Trametes versicolor utilizando matrices adsorbentes de Chitosán y de Eudragit E. El chitosán es un polielectrolitoes insoluble en medio neutro o alcalino y permite la elaboración económica de matrices de adsorción de intercambio aniónico. La matriz adsorbente de chitosán fue preparada por extrusión de una solución ácida de chitosan 3% utilizando una jeringa sobre una solución de NaOH. Las esferas resultantes fueron lavadas extensivamente en agua destilada y conservadas en medio fosfato 25 mM pH 7. Luego, fueron sometidas a ruptura con un molino a cuchillas para reducir el tamaño y aumentar el área superficial de la matriz. Las matrices adsorbentes de Eudragit E fueron preparadas por extrusión de una solución ácida de Eudragit 10% utilizando un espray sobre una solución de NaOH. La matriz resultante fue lavada extensivamente con agua destilada y conservada en medio fosfato 25 mM pH 7. Los resultados indican que el proceso de adsorción se pudo llevaró a cabo en menos de 10 minutos. Se logró purificar la lacasa del caldo de cultivo crudo, por adsorción en lote usando las matrices artesanales de chitosán y Eudragit E. La adsorción en lote se llevó a cabo en tanques agitados, poniendo en contacto las partículas adsorbentes con una suspensión biológicael caldo de cultivo proveniente una fermentación líquida. A las condiciones que se llevó a cabo la adsorción, pH 7 y baja fuerza iónica, se promueven las interacciones electrostáticas, que en este caso son de naturaleza atractiva ya que las matrices de chitosán portan una carga positiva , ymientras que la lacasa por estar a un pH mayor al punto isoeléctrico lleva una carga neta negativa. Luego de la captura de las proteínas de interés, la matriz adsorbente de chitosán se separó del caldo, se llevaron a cabo lavados y posteriormente y la proteína de interésla lacasa se eluyó, a alta fuerza iónica para promover la separación de la lacasa de las matrices de chitosán. Los resultados indican que, se obtuvo un factor de purificación mayor a 2,5 con matrices de Eudragit E y mayor a 4 con chitosán El rendimiento con Eudragit E fue de 17% mientras que con chitosán fue de 15%. El procedimiento proceso de adsorción/desorción mostró ser rápido, lo que evita que la enzima pierda actividad y es efectivo ya que con poca cantidad de material adsorbente se une una gran cantidad de enzima. Los resultados obtenidos indican que eEstos procesos de adsorción pueden ubicarse en las primeras etapas del aislamiento y purificación de las enzimas ya que permiten tratar el caldo de cultivo crudo sin que haya necesidad de tratamientos previos, a veces costosos, para la obtención de la enzima. Se debe hacer notar que tanto las matrices de chitosan como las de eudragit son económicas en cuanto al costo de los suministros y en la elaboración.Palabras-llave: Lacasa, adsorción, chitosan, eudragit.