Estudio preliminar de toxicidad de una nueva enzima fibrinolítica fúngica

ACOSTA, GABRIELA ALEJANDRA; FONSECA, MARIA ISABEL; FARIÑA, JULIA INES; ZAPATA, PEDRO DARIO

Posadas

Jornada; 1ras Jornadas Institucionales INBIOMIS : 10 años construyendo biotecnología; 2022

Instituto de Biotecnología Misiones, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Misiones

Las enzimas fibrinolíticas fúngicas son reconocidas como importantes agentes trombolíticos debido a su capacidad para disolver los coágulos sanguíneos. Nuestro grupo optimizó los parámetros de producción y purificación de una nueva enzima fibrinolítica secretada por Hornodermoporus martius LBM 224. El objetivo de este trabajo fue evaluar la toxicidad del sobrenadante de cultivo y de la enzima fibrinolítica purificada de H. martius LBM 224. Se realizó el ensayo de letalidad de 24 h en microplacas utilizando Artemia spp. como organismo de prueba. Los huevos de Artemia spp. se incubaron en agua de mar estéril con aireación constante a 25 ± 1 °C durante 48 h. Los nauplios fototrópicos maduros se recogieron y se colocaron de 10 a 15 organismos en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos con 100 μL de agua de mar. A cada pocillo se le agregaron por separado 100 μL del sobrenadante de cultivo y de la enzima purificada en buffer tris-HCl 50 mM pH 7,4. Como controles se utilizó: agua de mar estéril, agua destilada estéril, medio de cultivo sin el hongo, sobrenadante de cultivo desnaturalizado por calor, buffer acetato de sodio 50 mM pH 3,6 y 4,8, buffer fosfato de sodio 50 mM pH 5,6 y 6,7, buffer tris­HCl 50 mM pH 7,4. Además, se ensayaron el sobrenadante de cultivo y el medio de cultivo sin el hongo, ajustados a pH 7 con NaOH concentrado. La placa se incubó a 25 ± 1 °C durante 24 h. Luego se examinó con una lupa y se contó el número de nauplios muertos (no móviles). Finalmente se añadieron 100 μL de metanol a cada pocillo y después de 15 min, se contó el número total de nauplios muertos. Los ensayos se llevaron a cabo por quintuplicado y los resultados se expresaron como el porcentaje de mortalidad (%) para las diferentes condiciones ensayadas.Se demostró que la enzima purificada no exhibió toxicidad (0 % de mortalidad), mientras que el sobrenadante de cultivo mostró ser tóxico (100 % de mortalidad). Se comprobó que dicha toxicidad puede deberse no solo al pH sino también, a enzimas o compuestos termolábiles, debido a que al calentar el sobrenadante de cultivo ajustado a pH 7, la mortalidad se redujo del 73 % al 2 %. Además, se ensayaron diferentes buffers para evaluar el efecto del pH sobre la mortalidad de las Artemias y se comprobó que el pH del medio influye directamente sobre esta, ya que a medida que este disminuyó, aumentó la tasa de mortalidad. Finalmente se ensayó el medio de cultivo, que contenía 35 g/L de glucosa, y se observó un 100 % de mortalidad, demostrando la influencia de la isotonicidad del medio sobre la mortalidad.La prueba de Artemia spp. se considera una herramienta útil para la evaluación inicial de la toxicidad de micotoxinas, extractos y metabolitos fúngicos. Este método proporcionó datos preliminares que demostraron la ausencia de toxicidad de la enzima fibrinolítica purificada de H. martius LBM 224, los cuales deben ser respaldados por bioensayos más específicos.