PURIFICACIÓN DE UNA NUEVA ENZIMA FIBRINOLÍTICA SECRETADA POR Hornodermoporus martius LBM 224

ACOSTA GABRIELA ALEJANDRA; FONSECA MARIA ISABEL; FARIÑA JULIA INÉS; ZAPATA PEDRO DARÍO

Online

Simposio; 6º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2021

Universidad Nacional de Misiones

Las enzimas fibrinolíticas producidas por hongos han cobrado gran importancia para el tratamiento de enfermedades del sistema cardiovascular. Nuestro grupo de trabajo ha evaluado la capacidad Hornodermoporus martius LBM 224 de producir enzimas extracelulares con actividad fibrinolítica (Fb), lo cual ofrece una ventaja a la hora de su recuperación y purificación, y ha optimizado los parámetros de cultivo para la producción enzimática de interés. El objetivo de este trabajo fue purificar la enzima fibrinolítica producida por H. martius LBM 224. La purificación de la enzima fibrinolítica se realizó a partir del sobrenadante de cultivo en medio líquido optimizado (conteniendo en g/L: glucosa, 35; extracto de carne, 5; NaCl, 2; KH2PO4, 0,5 y MgSO4·7H2O, 0,5) a los 21 días de incubación a 28 °C, el cual se separó del micelio por centrifugación a 4.400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. El sobrenadante obtenido se filtró utilizando un filtro de jeringa (Biofil?) con una membrana de fluoruro de polivinilideno de 0,22 µm obteniéndose un sobrenadante enzimático libre de micelio y esporas. A continuación, se realizó una precipitación en dos etapas. En la primera etapa al sobrenadante se le adicionó 1 volumen de acetona fría (-18 °C) y se incubó con agitación constante en baño de hielo durante 1 h. Se centrifugó a 10.000 x g a 4 °C durante 30 min y los precipitados obtenidos en esta primera etapa se resuspendieron en agua destilada (P1) para su evaluación. Por otro lado, a los sobrenadantes obtenidos de la primera precipitación se les adicionó nuevamente 1 volumen de acetona fría bajo las condiciones anteriormente descriptas. Los precipitados obtenidos en esta segunda etapa se resuspendieron en agua destilada (P2) para su evaluación, mientras que los sobrenadantes se descartaron. La fracción P2 se separó mediante ultrafiltración (MWCO 30 kDa) utilizando columnas Pierce Concentrator (ThermoScientificTM). Las diferentes fracciones obtenidas: sobrenadante y cada etapa de recuperación/purificación parcial, se evaluaron mediante SDS-PAGE y la determinación de la cantidad de proteínas se realizó utilizando el reactivo de Bradford (Sigma Aldrich®) con albúmina de suero bovino como estándar. La actividad Fb se determinó mediante el método de degradación de fibrina de Wang et al. (2011) midiendo la absorbancia del producto de degradación de la fibrina a 275 nm. Las unidades de actividad enzimática, expresadas como unidades de degradación de fibrina (FU), se definen como el incremento de 0,01 unidades de absorbancia a 275 nm por min de reacción. Como resultado se obtuvo una enzima fibrinolítica purificada a homogeneidad, evidenciada por la presencia de una sola banda de 29 kDa en SDS-PAGE, con actividad Fb específica de 531,69 FU/mg, un factor de purificación de 3,9 y un rendimiento del 35,47 %. Este método de purificación resultó ser sencillo, económico y rápido, ya que no requiere equipos complejos y utiliza bajas proporciones de solvente, siendo una buena alternativa para la purificación de la enzima fibrinolítica secretada por H. martius LBM 224.