Desarrollo de una qPCR multiplex para la identificacion de BLV wild type y cepa atenuada

RIPOLL LAUTARO; PETERSEN MARCOS; GHIRINGHELLI P; KARINA TRONO

Valle Hermoso.Cordoba

Simposio; XXXVIII Reunion cientifica anual de la SAV; 2018

sociedad argentina de virologia

INTRODUCCIÓN:El virus de la leucosis bovina (BLV) tiene un importante impacto en la sanidad de los rodeos asociados a la producción de leche de Argentina y el mundo. En Argentina la prevalencia individual en vacas lecheras de zonas de alta producción supera el 80%. Este virus provoca mayormente infecciones persistentes asintomáticas, generando un reservorio del virus para su posterior diseminación. Alrededor del 5% de los bovinos infectados desarrolla linfosarcomas que causan la muerte del animal. Este virus pertenece a la familia Retroviridae. Tiene la capacidad de integrarse al genoma de linfocitos B y también de permanecer extracromosomalmente (lineal o circular) La detección del BLV se realiza mediante presencia de anticuerpos específicos circulantesó mediante PCR. Su detección no es mandatoria para el comercio interno de animales o producto. Sin embargo, muchos países exigen el control sanitario de en los protocolos de ingreso. Actualmente se está desarrollando una vacuna basada en una variante del virus BLV atenuado que permite la protección del animal. La evaluación de la vacuna conlleva el desarrollo de metodologías accesibles que permitan confirmar molecularmente la presencia de la variante atenuada y wild type, indistinguibles por su respuesta serológica.OBJETIVOAnte esta necesidad, se desarrolló un sistema de qPCR multiplex utilizando componentes producidos localmente. El mismo está basado en sondas de hidrólisis que permiten de detectar en una sola reacción tanto al fenotipo viral wild type como al atenuado. METODOLOGÍASe construyó una base de datos de genomas secuenciados de BLV. A partir de la misma se realizó un análisis bioinformático que permitió determinar regiones óptimas para el diseño de oligonucleótidos y sondas específicas. Cada combinación de primers fue evaluada en cuanto a su performance, especificidad, y capacidad para formar dímeros. Posteriormente se optimizó un sistema enzimático conteniendo todos los componentes necesarios para la reacción. Se acopló la enzima UDG (uracil-DNA glicosilasa) para disminuir contaminaciones generadas por arrastre de productos de amplificación. Se realizó la validación analítica del sistema utilizando los parámetros y juegos de oligonucleótidos previamente seleccionados. Luego se determinó la eficiencia del sistema utilizando muestras reales.RESULTADOSMediante la validación analítica se determinaron los parámetros de especificidad, límite de detección, y rango dinámico del sistema. Se obtuvo un límite de detección de 20 moléculas con un R2= 0,99 y 0,98 para la cepa wild type y atenuada respectivamente. Por otro lado, el sistema mostró ser 100% específico sobre las muestras evaluadas. Por último, se logró detectar tanto el virus wild type como su variante atenuada a partir de muestras de animales infectados y vacunados.