Puesta a punto de un ensayo para la detección de lentivirus de pequeños ruminantes CAEV y MVV

ALVAREZ IRENE; TRONO KARINA; RAIA ALEJANDRO; CARLOS ROSSANIGO

San Salvador de Jujuy

Otro; XXI Reunión Cientifico Tecnico de la AAVLD; 2016

AAVLD

Raia A., Rossanigo C., Trono K., Alvarez IPuesta a punto de un ensayo para la detección de lentivirus de pequeños ruminantes CAEV y MVVLos lentivirus de pequeños rumiantes (small ruminant lentiviruses ? SRLVs) son miembros de la familia de los Retrovirus y comprenden alVirus Maedi-visna (VMV) y al Virus de la arteritisencefalitis caprina (Caprine Arthritis-Encephalitis Virus- CAEV) que infectan a ovejas y cabras. La mayoría de los animales infectados son asintomáticos, solo un porcentaje desarrollan un síndrome clínicocaracterizados por una enfermedad inflamatoria multisistémica que afecta pulmones, sistema nervioso central, articulaciones y glándulas mamarias. A pesar de una fuerte respuesta inmune, el virus no pude ser eliminado y el animal permanece como portador por el resto de su vida, y puede transmitir la enfermedad a animales sanos.MVV y CAEVpueden ser aislados de explantos de tejidos o de fluidos mediante cocultivo con células permisivas por detección de efecto citopático. Es una técnica muy laboriosa y requiere de un laboratorio con gran equipamiento. El mejor método diagnósticoes la serología, ya que la detección de anticuerpos es indicativo que el animal contrajo la enfermedad. Los ensayos de PCR son muy útiles como métodos complementarios a los serológicos, especialmente durante el período de ventana o ante la presencia de anticuerpos calostrales. Las PCR permiten ademásconfirmar los hallazgos de cultivo celular yrealizar estudios de información epidemiológica molecular. Las muestras elegidas para la realización de ensayos de PCR son las células mononucleares de sangre periférica(PBMC),leche/calostro,líquidosinovial.Con el objetivo de disponer de una herramienta de diagnóstico rápida y complementaria para la detección de CAEV/MVV y se estandarizó la técnica de PCR según fue descripta por Olech y col. (2012) con algunas modificaciones, y se evaluó su performance al aplicarse para el diagnóstico deMVV y CAEVen muestras de campo procedentes de casos naturales y de aislamientos en cultivo celular. Materiales y métodos Se utilizó la cepa K1514prototipo de MVVamplificada en células GSM (membrana sinovial de cabra) para la puesta a punto del ensayo de PCR,comofuente de virus (RNA) y de provirus (DNA proviral). Se extrajo DNA y RNA de las distintas muestras utilizando kits comerciales. A partir del DNA extraído se detectó el provirus de CAEV/MVV mediante una reacción de PCR anidada del gen gag de CAEV/MVV según Olech y col (2012). Para la detección de ARN viral se realizó una reacción de trascripción reversa (RT) a partir de ARN extraído y tratado con endonucleasa RQ1 RNAse free DNase para degradar el DNA. La reacción de RT se llevó a cabo con M-MLV Reverse Transcriptase y random hexámeros. Una vez obtenido el ADN copia (ADNc) se amplificó por la misma reacción de PCR. Se estableció la temperatura de annealing de la reacción de PCR mediante un gradiente de temperatura. Se determinó el límite de detección de cada una de las reacciones utilizando diluciones de un lisado de células GSM infectadas con el virus K1514. Se analizaron distintos tipos de muestras con la PCR puesta a punto. A partir de DNA extraído de lisado de células GSM infectadas con MVV cepa K1514 se estableció el ciclado de la reacción de PCR donde se observaban la menor cantidad de bandas inespecíficas.Resultados Fue posible detectar CAEV/MVV en muestras de sangre entera, homogenatos de tejidos y en lisados celulares de co-cultivos de células GSM con líquido sinovial, PBMC y homogenatos de tejidos.El límite de detecciónobservado para la reacción de PCR a partir de RNA fue mayor que a partir de DNA cuando se analizaron diluciones de ambos ácidos nucleicos. Esta observación se repitió cuando se contaminaron experimentalmente diferentes matrices como sangre entera, leche,homogenato de tejidoscon diluciones del lisado celular de GSM infectado con MVV-K1514. La reacción de PCR fue específica para CAEV/MVV ya que ácidos nucleicos de diferentes patógenos de ovinos y caprinos resultaron negativos cuando fueron analizados con este ensayo de PCR.Conclusiones De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente trabajo, se pudo poner a punto un ensayo de PCR para la detección de CAEV/MVV, con resultados confiables. Esto permite contar con una herramienta de diagnóstico rápida, complementaria a la serología, para la detección de animales infectados con CAEV/MVV, así como para la detección de los agentes en los ensayos de aislamiento a partir de cultivo de células.