Vitrificación de espermatozoides porcinos y evaluación de su capacidad de producir embriones mediante la técnica ICSI

CLAUDIA ARRAZTOA; CLARA BACA CASTEX; GABRIEL MARTIN ALVAREZ; PABLO DANIEL CETICA; DEBORA NEILD

CABA

Congreso; 2° Congreso internacional de la SATE; 2014

Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias

La vitrificación de espermatozoides porcinos en ausencia de crioprotectores, mediante el método de esferas, permite conservar la condensación e integridad de la cromatina espermática. Esta condición, hace de la vitrificación un modelo de criopreservación de espermatozoides con utilidad en biotecnologías como ICSI. Objetivo: vitrificar espermatozoides porcinos y evaluar su capacidad de producir embriones mediante la técnica ICSI. Materiales y Métodos: se vitrificó, con el método de esferas, semen porcino fresco mejorado por filtración a través de lana de vidrio, diluido a 5 x 106 esp./ml en TALP sin crioprotector, suplementado con 1% de BSA (T). Las esferas permanecieron en nitrógeno líquido un mínimo de 24 hs y se atemperaron en medio T a 37º C / 30?. Se evaluó: movilidad, funcionalidad de membrana plasmática (HOS), viabilidad espermática (CFDA-Pi), integridad acrosomal (contraste de fase), condensación (Azul de Toluidina) y susceptibilidad de la cromatina espermática a la desnaturalización ácida (Naranja de Acridina). Se obtuvieron COCs por aspiración de folículos antrales (3-8 mm), de ovarios de faena y se maduraron en medio TCM-199 suplementado con cisteina, hormona folículo estimulante porcina (FSH), homona luteínica porcina (LH) y líquido folicular, a 39° C durante 48 hs con 5% de CO2. Durante la ICSI, los ovocitos con corpúsculo polar visible se colocaron en gotas de HEPES-TALP suplementado con 0,3% de BSA y la suspensión de semen vitrificado-atemperado (grupo tratamiento) o semen diluido y mantenido a 17° C (grupo control), se colocó en gotas de polivinilpirrolidona al 10%. El proceso se realizó a 38° C. Como control de activación partenogenética, se ensayó la técnica de Sham. Los ovocitos inyectados se cultivaron en medio G1 a 38° C y atmósfera de 5% de CO2. Se evaluó la presencia de pronúcleos (PN) a las 18 hs de cultivo, fijando y tiñendo los presuntos cigotos con Hoechst 33342. Los datos fueron analizados utilizando una comparación de proporciones. Resultados: los únicos parámetros seminales que luego de la vitrificación no presentaron diferencias significativas (P>0,05) con las muestras previas a vitrificar fueron: la condensación (89,9% ± 0,8 vs. 93,3% ± 0,7) y la integridad de la cromatina espermática (97,2 ± 1,9 vs. 91,2% ± 5,2) (media ± error estándar). No se observaron diferencias significativas (P>0,05) entre el grupo control y el grupo tratamiento en el desarrollo embrionario temprano hasta estadio de PN (31,8%; 36/113 vs. 35,5%; 32/90 respectivamente). Los ovocitos sometidos a Sham (30) no presentaron activación. Conclusión: La vitrificación espermática porcina en esferas, a una concentración de 5 x 106 esp./ml de medio TALP sin crioprotector, suplementado con 1 % de BSA, permitiría conservar la cromatina de los espermatozoides, manteniendo la capacidad de producir desarrollo embrionario temprano hasta estadio de pronúcleos, por medio de la técnica ICSI.