ACTIVIDAD ENZIMÁTICA COMPARADA DE PLCɀ EN ESPERMATOZOIDES BOVINOS Y EQUINOS

GIGLIO, NICOLAS; ALVAREZ, G.; ELIZABETH BREININGER; CETICA, P.

CABA

Jornada; XI Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2022

Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA

Actividad enzimática comparada de PLCɀ en espermatozoides bovinos y equinosGilio Nicolas1, Alvarez Gabriel 1, Breininger Elizabeth 1,2, Cetica Pablo 1,21 Universidad de Buenos Aires - CONICET, Instituto de Investigaciones en Producción Animal (INPA), Buenos Aires, Argentina. 2 Universidad de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Veterinarias, Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA), Cátedra de Química Biológica, Buenos Aires, Argentina.La inyección intracitoplasmática de un espermatozoide (ICSI) dentro de un ovocito maduro es una técnica utilizada con éxito para fecundar ovocitos equinos, sin embargo en la especie bovina su eficacia es limitada. La fosfolipasa C zeta (PLCɀ) es una enzima específica del espermatozoide considerada como un factor clave para la activación del ovocito al utilizar esta técnica. Esta enzima es responsable de generar oscilaciones de calcio en el ovocito que desencadenan la exocitosis de gránulos corticales, el bloqueo de la polispermia, la reanudación de la meoisis y el desarrollo pronuclear. El objetivo del presente estudio fue comparar la actividad de la enzima PLCɀ en espermatozoides de bovinos y equinos. Se evaluaron 3 muestras de semen de cada especie provenientes de pajuelas conservadas en nitrógeno líquido. Las pajuelas se descongelaron en baño termostático a 37ºC durante 1 minuto, se diluyeron con PBS y se evaluó la motilidad por microscopía óptica y platina térmica. Las muestras se centrifugaron a 300xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 500 µl de agua destilada. La concentración espermática se determinó por hematocitometría en cámara de Neubauer. Cada muestra se conservó a -20ºC hasta su evaluación (máximo 3 meses de conservación). Para obtener el extracto enzimático, cada muestra se descongeló a temperatura ambiente, se homogeneizó y se sonicó durante 4 minutos (amplitud de onda de 2, ciclo del 50% y pulso continuo). Luego se centrifugaron durante 20 minutos (10.000xg, 4°C) y se recuperó el sobrenadante. Las muestras se mantuvieron refrigeradas durante todo el procedimiento. La actividad de la enzima se midió por espectrofluorometría utilizando un protocolo basado en la escisión del sustrato glicerofosfoetanolamina (EnzChek® Direct Phospholipase C Assay Kit, E10215, Molecular Probes). Los resultados se expresaron como media ± desvío estándar (mU/106 espermatozoides) y evaluados por la prueba t de Student (p