A new method for simultaneous detection and discrimination of Bovine herpesvirus types 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) using high resolution melting (HRM) analysis

MS MARIN; S QUINTANA; MR LEUNDA; M RECAVARREN; I PAGNUCO; E SPATH; S PÉREZ; A ODEÓN

Congreso; XX Reunión científica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico (AAVLD).; 2014

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico (AAVLD).

Introducción Los Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) y tipo 5 (BoHV-5) son dos alfaherpesvirus estrechamente relacionados que infectan al ganado. Dada su gran similitud, su diferenciación no se logra mediante técnicas virológicas clásicas. Por lo tanto, los virus aislados y muestras obtenidas de animales afectados deberían analizarse mediante métodos moleculares sensibles y confiables. La técnica de High Resolution Melting (HRM) fue desarrollada recientemente como una extensión de los análisis de la curva de disociación (o "fusión") del ADN que se lleva a cabo en los aparatos de PCR en Tiempo Real convencionales. Se utiliza para caracterizar las muestras de ADN de acuerdo con su comportamiento de disociación en la transición a partir del ADN de doble cadena a ADN de cadena sencilla al aumentar la temperatura, lo cual es altamente dependiente de la secuencia de nucleótidos. Hasta el momento, esta metodología no había sido implementada para la identificación de los herpesvirus bovinos. El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de PCR en Tiempo Real con análisis por HRM para la detección simultánea y diferenciación de BoHV-1 y BoHV-5. Materiales y Métodos Se extrajo el ADN total a partir de cepas de referencia de BoHV-1 (LA y Cooper) y de BoHV-5 (N569 y A663), 10 aislamientos argentinos de campo de BoHV-1 y 1 de BoHV-5, 5 muestras clínicas positivas por PCR convencional y 45 muestras del aparato respiratorio de animales infectados experimentalmente, utilizando un kit comercial (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Para identificar los cebadores con mayor eficiencia, se evaluaron tres pares de cebadores. Las secuencias correspondientes al fragmento amplificado, fueron alineadas y comparadas con el programa MAFFT (Katoh y Standley, 2013). Las condiciones del ensayo fueron optimizadas utilizando diferentes concentraciones de cebadores, temperaturas y tiempos de annealing. Las amplificaciones de PCR en Tiempo Real se llevaron a cabo en un termociclador Rotor Gene Q, en un volumen final de 20 ul utilizando EvaGreen como intercalante fluorescente (KAPA HRM FAST, Biosystems, Woburn, USA). El programa de ciclado consistió en una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 50 ciclos de 15 s a 95 °C, 15 s a 58 °C y 20 s a 72 °C. Al finalizar la reacción se efectuó un análisis de la curva de HRM y la identificación del genotipo viral. La sensibilidad analítica y especificidad del ensayo fueron determinadas; asimismo, se comparó esta técnica con el aislamiento viral y PCR convencional (Campos et al., 2009) utilizando las muestras de aparato respiratorio. La concordancia entre las tres metodologías se evaluó mediante el coeficiente kappa de Cohen y la diferencia entre los coeficientes fue calculada mediante la prueba de Chi-cuadrado (P