Puesta a punto de una PCR en Tiempo Real para diferenciar Brucella abortus S19 de Brucella abortus cepa de campo

MARIANA RECAVARREN; QUINTANA SILVINA; FIORENTINO, ANDREA

Congreso; 35º Congreso Argentino de Producción Animal; 2012

Asociaciòn Argentina de Produccciòn Animal

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar la técnica de PCR en Tiempo Real para detectar ADN de las cepas vacunal (S19) e infectiva (CC) de Brucella abortus, a partir de cultivos puros y de muestras de sangre de vaquillonas vacunadas a los ? y sangradas a los ?. días post vacunación. Se realizaron las pruebas de aglutinación en placa (BPA) y tubos (SAT y 2-ME) y de Polarización de Fluorescencia (FPA). Se realizó extracción, cuantificación y amplificación por PCR en Tiempo Real de ADN de cultivos puros de Brucella abortus S19 y CC. Se realizó una amplificación con primers que detectan ADN de bovinos con el fin de chequear el éxito de la extracción de ADN y la inexistencia de inhibición en la reacciones de PCR. Una vez corroborado esto, se pusieron a punto las reacciones de PCR en Tiempo Real para detectar ADN de Brucella abortus en 14 muestras de suero de vaquillonas positivas a BPA, SAT, 2-ME y FPA, utilizando primers que amplificaron un fragmento de 361 pb para S19 y de 178 pb para CC. Las reacciones de PCR en Tiempo Real se llevaron a cabo en un volumen final de 20 µl, utilizando Eva Green como intercalante fluorescente, se efectuó una curva de melting para corroborar la amplificación del producto del PM esperado. Se determinó la inexistencia de amplificación inespecífica de los primers entre ambas cepas. Mediante esta técnica se logró amplificar exitosamente ADN de Brucella abortus a partir de cultivos puros de las cepas S19 y CC con una sensibilidad >0,05 ng de ADN en ambos casos. De las 14 muestras de suero de bovinos positivos a brucelosis por las técnicas de BPA, SAT, 2-ME y FPA, se determinó por PCR en Tiempo Real, que solo 4 fueron positivas para la CC. Otras 4 fueron positivas para S19 y 6 fueron positivas para CC y S19, indicando esto último que habría coexistencia entre cepa infectante y vacunal al momento del sangrado (Tabla 1). La PCR en Tiempo Real es una técnica altamente sensible que permitiría diferenciar muestras positivas a Brucelosis debidas a infección o post vacunación. Tabla 1: Diagnóstico de Brucelosis en vaquillonas por BPA, WRIGHT, 2-ME, FPA y PCR en Tiempo Real. ANIMAL BPA WRIGHT 2-ME FPA mp PCR S19a PCR CCb 38 + Ic 200 50 105 Pd POSITIVO 65 + 200 I 100 106 Se POSITIVO 66 + I 100 50 102 S POSITIVO 75 + 200 100 110 P POSITIVO 76 + 200 50 103 S POSITIVO POSITIVO 77 + I 200 50 103 S POSITIVO 81 + I 200 100 112 P POSITIVO 4786 + I 100 I 100 133 P POSITIVO POSITIVO 4790 + 100 50 106 P POSITIVO POSITIVO 4809 + 200 50 105 P POSITIVO POSITIVO 5002 + I 100 50 94 S POSITIVO 5003 + I 200 100 130 P POSITIVO POSITIVO 9001 + 100 100 124 P POSITIVO POSITIVO 9006 + 200 I 100 120 P POSITIVO a Primer específicos para S19 b, Primers específicos para CC; c I: Abreviatura de Incompleto; d: muestra positiva por FPA dado que es mayor ≥105 mP; e: muestras sospechosa por FPA dado que se encuentre en el rango de 94-104 mP. Palabras claves, Brucelosis, Cepa vacunal e infectante, PCR en Tiempo Real.