Técnica de PCR en tiempo real para Neospora caninum en tejidos de fetos bovinos abortados.

RECAVARREN MARIANA; QUINTANA SILVINA; MORRELL ELEONORA; PAOLICCHI F; ODEÓN A; MOORE DP

Congreso; 37° Congreso Argentino de Producción Animal; 2014

Asociaciòn Argentina de Produccciòn Animal

La neosporosis bovina es una enfermedad parasitaria caracterizada por provocar abortos y signos neurológicos en los temeros recién nacidos causada por Neospora caninum. El diagnóstico de la infección puede realizarse en forma indirecta a través de la detección de anticuerpos específicos utilizando técnicas serológicas como inmunofluorescencia o ELISA. El diagnóstico directo consiste en la identificación del protozoo mediante la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) en tejidos fetales con lesiones necrotizantes e inflamatorias en sistema nervioso central (SNC), corazón, pulmón e hígado; sin embargo esta técnica tiene baja sensibilidad pudiéndose realizar diagnósticos falsos negativos. El objetivo de este trabajo fue evaluar la aplicación de técnica de PCR en tiempo real como método diagnóstico de neosporosis bovina en muestras de fetos bovinos abortados procesados en el Servicio de Diagnóstico Veterinario Especializado, INTA Balcarce. Materiales y métodos Se utilizaron muestras de SNC, pulmón e hígado de 46 fetos bovinos con diagnóstico presuntivo de neosporosis por la presencia de lesiones de meningoencefalitis necrotizante multifocal, miocarditis, hepatitis y placentitis no supurativas. Se logró extraer y amplificar ADN de las muestras de tejidos utilizando como control interno amplificaciones con cebadores que detectan ADN bovino. En aquellas muestras aptas se realizó la detección de N. caninum con cebadores que amplifican un fragmento de 76 pb del genoma del parásito mediante PCR en tiempo real; utilizando como control positivo ADN de taquizoítos puros. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando una mezcla preformada con el intercalante fluorescente EvaGreen, en un volumen final de 20 µl y por duplicado. La detección del producto amplificado se monitoreó en un equipo Rotor Gene Q y el producto específico de amplificación de N. caninun presentó una temperatura de melting de 81,5 °C. Se realizó un análisis de concordancia utilizando el test de kappa. Resultados y Discusión Los resultados de los fetos positivos a IHQ y PCR en tiempo real se resumen en la Tabla 1. La técnica de PCR en tiempo real detectó un 85% (29/34) de positivos respecto del 47% (16/34) de la IHQ, aunque el análisis de concordancia no fue significativo. Aunque la IHQ permite localizar el protozoo asociado a la lesión histopatológica, las técnicas de PCR y particularmente la PCR en tiempo real permiten incrementar notablemente la sensibilidad diagnóstica. Más aún, casi el 30% de los fetos tienen lesiones histopatológicas siendo indeterminado el diagnóstico definitivo por la baja sensibilidad de las técnicas de aislamiento y/o cultivo (Campero et al., 2003). Aunque la técnica de PCR cualitativa ha sido ya utilizada para incrementar la eficiencia en el diagnóstico del aborto bovino causado por N. caninum (Moore et al., 2008); en este trabajo se destaca la puesta a punto y utilidad de la PCR en tiempo real para detectar la presencia de ADN del mencionado protozoo a partir de fetos abortados. Tabla 1: Diagnóstico de N. caninum en fetos bovinos abortados por IHQ y PCR en tiempo real. Fetos IHQ (+) Fetos IHQ (-) no realizada por IHQ TOTAL Fetos PCR tiempo real (+) 14 15 11 40 Fetos PCR tiempo real (-) 2 3 1 6 TOTAL 16 18 12 46 Conclusiones Se implemento la técnica de PCR en tiempo real que detectó ADN de N. caninum en muestras clínicas de fetos bovinos abortados. La técnica de PCR en tiempo real detectó un 85% de positivos respecto del 47% de la IHQ. El diagnóstico de N. caninum en bovinos realizado por PCR en Tiempo Real puede ser usado como complemento de la técnica de IHQ. Agradecimientos Los autores agradecen el financiamiento otorgado por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica mediante el instrumento FONTAR ANR 800 0094/11. Referencias: 1. Campero, C.M., Moore, D.P., Odeón, A.C., Cipolla, A.L., Odriozola, E. 2003. Aetiology of bovine abortion in Argentina. Veterinary Research Communications. 27: 359?369. 2. Moore D.P., Regidor-Cerrillo J., Morrell E., Poso M.A., Cano D.B., Leunda M.R., Linschinky L., Odeón A.C., Odriozola E., Ortega-Mora L.M., Campero C.M., 2008. The role of Neospora caninum and Toxoplasma gondii in spontaneous bovine abortion in Argentina. Veterinary Parasitology. 156: 163?167. .