Extracción, retrotranscripción y amplificación por PCR de transcriptos de ARN obtenidos de bloques de parafina de testículos de ratón fijados en formaldehído al 10 % o en líquido de Boiun

QUINTANA SILVINA; VENARA MARCELA; REY RODOLFO; CHEMES HÉCTOR

Mar del Plata, Buenso Aires , Argentina

Congreso; 50° Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2005

Sociedad Argentina de Investigación Clínica

Nuestro objetivo fue establecer si es factible realizar estudios de expresión génica a partir de bloques de parafina de tejido testicular de ratones transgénicos portadores de una construcción con la región promotora de la AMH (Hormona antimulleriana) y el oncogen Simian Virus 40 (SV40). Estos animales desarrollan tumores testiculares del estroma gonadal que hemos caracterizado inmunohistoquímicamente. Tradicionalmente, se ha considerado que el ARN contenido en tejidos procesados para estudio histológico presenta un alto nivel de degradación que impide su utilización en estudios moleculares. Sin embargo, experiencias recientes han indicado que se pueden realizar estudios de expresión génica a partir de dicho material.Para este estudio utilizamos cortes histológicos de 12 a 15 m de espesor de bloques de archivo, fijados en Formol o en Bouin,. Luego de la desparafinización e hidratación se llevó a cabo un protocolo de extracción de RNA incubando con Proteinasa K a 60°C , seguida de una extracción con fenol cloroformo (pH4) y posterior precipitación con isopropanol. El RNA obtenido fue digerido con desoxirribonucleasa y se precipitó nuevamente. Se efectuó una retrotranscripción con hexámeros "random" y una posterior amplificación por PCR con primers de beta actina .El RNA extraído estaba sumamente degradado, no observándose las bandas del ARN ribosomal en una electroforesis en gel de agarosa. El cDNA obtenido presentó fragmentos menores a 500 pares de bases. Se logró amplificar por PCR un producto de 280 pares de bases del Exón 3 de la beta actina en cortes provenientes de material fijado en formol o en líquido de Bouin. Estos resultados indican que es posible obtener RNA a partir de tejido embebido en parafina procesado con diferentes fijadores. El cDNA proveniente de estas muestras se puede amplificar por PCR, lo cual convierte a los tacos de archivo en una invaluable fuente para estudios moleculares retrospectivos en patologías experimentales o clínicas.la región promotora de la AMH (Hormona antimulleriana) y el oncogen Simian Virus 40 (SV40). Estos animales desarrollan tumores testiculares del estroma gonadal que hemos caracterizado inmunohistoquímicamente. Tradicionalmente, se ha considerado que el ARN contenido en tejidos procesados para estudio histológico presenta un alto nivel de degradación que impide su utilización en estudios moleculares. Sin embargo, experiencias recientes han indicado que se pueden realizar estudios de expresión génica a partir de dicho material.Para este estudio utilizamos cortes histológicos de 12 a 15 m m de espesor de bloques de archivo, fijados en Formol o en Bouin,. Luego de la desparafinización e hidratación se llevó a cabo un protocolo de extracción de RNA incubando con Proteinasa K a 60°C , seguida de una extracción con fenol cloroformo (pH4) y posterior precipitación con isopropanol. El RNA obtenido fue digerido con desoxirribonucleasa y se precipitó nuevamente. Se efectuó una retrotranscripción con hexámeros "random" y una posterior amplificación por PCR con primers de beta actina .El RNA extraído estaba sumamente degradado, no observándose las bandas del ARN ribosomal en una electroforesis en gel de agarosa. El cDNA obtenido presentó fragmentos menores a 500 pares de bases. Se logró amplificar por PCR un producto de 280 pares de bases del Exón 3 de la beta actina en cortes provenientes de material fijado en formol o en líquido de Bouin. Estos resultados indican que es posible obtener RNA a partir de tejido embebido en parafina procesado con diferentes fijadores. El cDNA proveniente de estas muestras se puede amplificar por PCR, lo cual convierte a los tacos de archivo en una invaluable fuente para estudios moleculares retrospectivos en patologías experimentales o clínicas.