Caracterización funcional de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) de Leishmania major

SOSA, M; NOWICKI, C

Ascochinga

Congreso; XXIV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

Sociedad Argentina de Protozoología (SAP)

Las fosfoenolpiruvato carboxiquinasas (PEPCKs) están altamenteconservadas en los genomassecuenciados de Leishmania y tripanosomas. En L. mexicana se observó que laactividad de PEPCK essignificativamente más alta (10 veces) en amastigotes-like que en promastigotes. Además, hallazgos mucho más recientes demostraron que en amastigotes la incorporación de aminoácidos como el L-Asp y la L-Ala en polímeros de-mananos es más activa que en promastigotes, y que en Leishmania y en T. cruzi los niveles de expresión de los transportadores de glucosa disminuyen significativamente en los estadios del mamífero. Estas evidencias en su conjunto llevaron a considerar la posibilidad de que amastigotes de T.cruzi y Leishmania dependieran de la gluconeogénesis no sólo para generar glucosa como fuente deenergía sino también utilizarla como precursor en la síntesis de las variadas moléculas de glicoconjugadosque estos parásitos poseen. Se postula que la PEPCK sería una de las enzimas involucradas en la síntesisde novo de glucosa. Sin embargo, no se han estudiado las propiedades de ninguna PEPCK de Leishmania,sólo se purificó y caracterizó la enzima de T. cruzi. Por estas razones abordamos la caracterización de laenzima de L. major.  La PEPCKrecombinante con una extensión de 6xHis en el N-terminal se expresó en E.coli y su caracterización cinética mostró que el Km aparente para el fosfoenolpiruvato (1.9 mM) erallamativamente más alto que el valor observado para muchos otros homólogos devariados orígenes,incluyendo a la enzima de T. cruzi. Con el fin de comprobar que el Tag no interfiriera en la función, serealizó una construcción que no incluyera etiqueta de afinidad alguna, y aprovechando el alto pI de la PEPCK de L. major la proteína recombinante se purificó mediante un único paso cromatográfico deintercambio catiónico. Análisis por electroforesis en condiciones desnaturalizantes y degradación de Edman confirmaron la pureza de la PEPCK de L. major. La caracterización funcional de esta variante arrojó valores de parámetros cinéticos similares a los previamente obtenidos, determinándose Kms aparentes de1.7mM, 0.1 mMy 0.06 mM para el fosfoenolpiruvato, ADP y oxalacetato, respectivamente. Estos resultados confirman que a diferencia de las PEPCKs de otros orígenes, la enzima de L.major presenta una afinidad aparente notoriamente baja para el fosfoenolpiruvato, indicando que como en los mamíferos, es probable que la función de esta enzima esté relacionada con la formación de fosfoenolpiruvato a partir de oxalacetato y ATP.