Propiedades cinéticas de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) de L. major. Mapeo de su sitio activo activo por mutagénesis

SOSA, M; NOWICKI, C

Rosario

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2013

Sociedad Argentina de Protozoología (SAP)

En TriTryps, la PEPCKes una enzima glicosomal altamente conservada que contribuye a la producción deNAD+ y ATP en la organela. Al igual que sus homólogos de bacterias,levaduras y plantas utiliza ATP/ADP, en cambio sus contrapartes de mamíferos dependen de GTP/GDP. La estructura 3D de la enzima de T. cruzi es prácticamente sobreimponible con la determinada para la enzima de E. coli, sin embargo como se carece de estructuras con análogos de sustratos faltaría confirmar los residuos del sitio activo participantes en la catálisis. Particularmente en Leishmania sp., las PEPCKs vincularían el metabolismo de carbohidratos con el de aminoácidos y el ciclo de Krebs. Estas funciones no serían equivalentes a lo largo del ciclo de vida de tripanosomas y leishmanias. Observaciones de larga data indican que en L. mexicana la actividad de PEPCK es mucho más elevada en extractos crudos de amastigotes que en los del estadio del insecto. En este trabajo describimos las propiedades cinéticas de la PEPCK de L. major y mediante mutagénesis puntual realizamos un mapeo de los potenciales residuos involucrados en la catálisis.La enzima recombinante expresada en E.coli presenta valores de Vmax de 67 ± 3.2 UE.mg-1 en el sentido de la formación de oxalacetato (OAA) y 53 ± 2.6 UE.mg-1 cuando cataliza la de formación de PEP. Para los sustratos de la primera reacción se determinaron kms aparentes de 0.91, 0.09 y 12.3 mM para el PEP, ADP y NaHCO3, respectivamente. En cambio para el OAA y ATP obtuvieron valores de kmaparentes de 0.09 y 0.05 mM. Las sustituciones de los residuos Tyr180 por Phe y Ala junto con la de Arg43por Gln corroboraron la participación de los mismos en la correcta orientación del PEP y la fijación del CO2. El cambio de la His205 por Gln puso en evidencia la necesidad del grupo imidazol para la formación del complejo decoordinación con el Mn2+, esto se reflejó en un aumento de más de 100 órdenes de magnitud en el km para ese cofactor.