Immunogenicity of exported and membrane proteins during Anaplasma marginale infections

NUÑEZ P.; MORETTA R.; RUYBAL P.; PETRIGH R.; DRAGHI G.; DE ECHAIDE ST; FARBER M.

Córdoba

Congreso; Reunión anual de la Asociación argentina de microbiología; 2007

Asociación argentina de microbiología

En Argentina Patógenos del género Anaplasma y Ehrlichia dentro orden Rickettsiales constituyen la mayor causa de enfermedades trasmitidas por garrapatas en animales y humanos. Anaplasma marginale causa la anaplasmosis bovina, enfermedad infecciosa que posee una alta morbilidad y mortalidad en el ganado. Ensayos de otros autores con vacunas recombinantes basadas en proteínas de superficie confirieron protección parcial, poniendo de relevancia la búsqueda de nuevos antígenos que garanticen una efectiva respuesta protectiva. Previamente en nuestro laboratorio, a través de una biblioteca de proteínas de fusión a fosfatasa alcalina y utilizando la estrategia de hibridización sustractiva basada en la técnica de PCR, se identificaron genes que codifican para proteínas de exportación o de membrana. Por otra parte, a través de análisis bioinformático se identificaron proteínas con presencia de péptido señal y segmentos trasmembrana utilizando los programas signalP, Psort y TMPred. Asimismo, se analizó a través de genómica comparativa utilizando BLAST la presencia y secuencia de estos genes en los microorganismos del orden rickettsiales. Los genes AM127 (L22) y AM1108 (phoAC) que fueron seleccionados a partir de las estrategias experimentales presentan dos segmentos trasmembrana y pertenecen a un cluster conservado entre patógenos intracelulares y endosimbiontes. A partir del análisis bioinformático se seleccionó el gen AM216 (Adh), que posee un segmento trasmembrana y pertenece a un cluster conservado entre Anaplasmas y Ehrlichias. Las secuencias de las proteínas seleccionadas amplificadas por PCR fueron clonadas en vectores pRSET para la expresión de proteínas recombinantes con fusión a histidina en E coli como ORFs completos o divididos en Nt y Ct terminal. Se evaluó la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes a través de ensayos de linfoproliferación por estimulación de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) de bovinos naturalmente infectados. Mediante western blot se evaluó la reactividad frente a sueros positivos y negativos. Se comprobó una estimulación específica significativa cuando los PBMC provenientes de un animal infectado fueron estimulados con los antígenos phoAC ORF y Adh Ct, observándose por otra parte una proliferación específica aunque de menor intensidad para los antígenos Adh Nt y L22 Nt. Finalmente, se observó reactividad específica de phoAC ORF frente a sueros positivos. Este trabajo aporta la identificación y caracterización de nuevos antígenos candidatos capaces de estimular una respuesta inmunológica específica, los cuales representan blancos potenciales para ser estudiados en nuevas formulaciones vacunales.