XylCLEAs inmovilizados en nanopartículas magnéticas, diseñadas a partir de proteína amiloidea

JOHAN S. HERO; ANDRÉS H. MORALES; NORA I. PEROTTI; MARÍA A. MARTÍNEZ; CINTIA M. ROMERO

Buenos Aires

Encuentro; XIX Encuentro de Superficies y Materiales Nanoestructurados; 2019

CNEA - INTI - INN CNEA-CONICET

La inmovilización es una manera de incrementar la vida útil de los biocatalizadores por estabilización de los mismos y por la posibilidad de reutilización en varios ciclos. Dentro de los métodos de inmovilización, una de las técnicas atractivas por simplicidad y costo es la producción de agregados enzimáticos entrecruzados o CLEAs (cross-linked enzyme aggregates), como enzimas inmovilizadas libres de soporte. Sin embargo, para muchos sustratos insolubles la separación de estos agregados por filtración y/o centrifugación resulta ineficiente, por lo tanto, la inmovilización con nanopartículas magnéticas (MNPs) resulta en un método de fácil recuperación. El objetivo del presente trabajo es analizar los factores que conforman la matriz de inmovilización de enzimas del tipo glicósido-hidrolasa, en la formación de XylCLEAs magnéticos, con el propósito de maximizar la actividad catalítica sobre sustratos naturales (xilano de birchwood). Se empleó el catalizador optimizado según Hero y col. [1], y se aplicó un diseño superficie en respuesta con los siguientes factores: relación MNPs Fe3O4 5, 10 y 20 mg por mg de proteínas presente en el sobrenadante libre de células; porcentaje de saturación del (NH4)2SO4 (60%, 80% y 100%); y el tipo de agente entrecruzante empleado en la matriz, glutaraldehído (GA) 0,025% (p/v), o un complejo de biopolímero-proteína amiloidea (BPPA) producido a partir del biofilm de Bacillus sp. Mcn4 0,025% (p/v), sometido a un tratamiento oxidativo. La respuesta evaluada fue actividad xilanolítica [1]. El análisis estadístico del modelo empleado resultó en un R2adj. del 97%, validando el diseño. Todos los factores evaluados tuvieron un efecto significativo (p<0,05), y sólo se observó interacción significativa entre el agente entrecruzante y los demás factores. Cuando el BPPA fue empleado, cambios en el factor MNPs/proteína no mostraron diferencias importantes en la actividad enzimática; por otra parte, incrementos en esta relación afectaron de forma positiva el sistema catalítico, cuando la inmovilización se realizó con GA. Analizando el efecto del (NH4)2SO4 se observó que el agente entrecruzante ocasionó una diferencia en la magnitud de la respuesta; cuando el mismo fue BPPA, el aumento de la concentración del (NH4)2SO4 ocasionó una fuerte disminución en la actividad del sistema catalítico, este efecto fue atenuado cuando la matriz se conformó con GA. Cabe destacar que la actividad de los biocatalizadores formados con BPPA en todas las condiciones evaluadas fue siempre igual o significativamente superior que todos los XylCLEAs obtenidos empleando GA. Las condiciones de los factores que maximizan la actividad de los sistemas catalíticos con GA fueron: (NH4)2SO4 60%, MNPs/proteína 20/1, con un título de 5,55±0,21 IU/ml. Estos valores, cuando se empleó BPPA, corresponden a (NH4)2SO4 60%, MNPs/proteína 5/1, con un título de 10,76±0,47 IU/ml. En conclusión, se logró diseñar un catalizador eficiente empleando una matriz de inmovilización con nanopartículas magnéticas que mejoran su reutilización, con un novedoso agente entrecruzante (BPPA) que incrementa en un 97% la actividad enzimática con respecto a la utilización del GA, empleado rutinariamente en la tecnología de CLEAs