INTERACCIÓN DE Hsp70/CHIP/Nox4-NAD(P)H-oxidasa EN EL EFECTO ANTIOXIDANTE DE LOSARTAN EN CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS EPITELIALES TUBULARES PROXIMALES DE SHR

GIL LORENZO ANDREA; COSTANTINO VALERIA; BOCANEGRA VICTORIA; CACCIAMANI VALERIA; BENARDON MARÍA EUGENIA; GARRAMUÑO VALLÉS, PATRICIA

Congreso; XXXIV Reunión Científica Anual del Consejo Argentino de Hipertensión Arterial (CAHTA), ?Dr. Eduardo Brawn Menendez? ? Sociedad Argentina de Cardiología; 2013

INTERACCIÓN DE Hsp70/CHIP/Nox4-NAD(P)H-oxidasa EN EL EFECTO ANTIOXIDANTE DE LOSARTAN EN CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS EPITELIALES TUBULARES PROXIMALES DE SHR. Gil Lorenzo AF1, Costantino VV1, Bocanegra V1, Cacciamani VE2, Benardon ME2, Vallés P1,2. 1IMBECU-CONICET. 1Área de Fisiología Patológica. Departamento de Patología. FCM. UNCuyo. Mendoza. Argentina Introducción. La expresión completa de la señalización de angiotensina II (AII) depende de la interacción dinámica del receptor AT1R con Caveolina 1 presente en la membrana lipídica y de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) por ensamblaje y activación del sistema NAD(P)H-oxidasa. Nox4, subunidad de este complejo enzimático, se expresa en células epiteliales tubulares proximales (PTCs). Hsp70 protege ante el estrés oxidativo, regula diversas vías de señalización y participa en el transporte de proteínas a localizaciones intracelulares específicas. CHIP, una ligasa de Hsp70 y ubiquitina E3, interviene en la ubiquitinación, agregación y degradación proteica. Objetivo. Investigar la contribución de Hsp70/CHIP en la regulación de Nox4 después del bloqueo del receptor AT1R, en cultivos de células epiteliales tubulares proximales de ratas espontáneamente hipertensas SHR. Métodos. Cultivos primarios de PTCs SHR y controles normotensos WKY de 8-10 semanas, fueron estimulados con angiotensina II (AII: 100 nmol/L) durante 15 min o tratados con losartan (L: 100 μmol/L) durante 90 min o con losartan por 75 min y posteriormente estimuladas con AII por 15 min (L+AII) en medio libre de suero. Cultivos sin tratar se utilizaron como control. La expresión de proteínas fue analizada por Western blot (WB) y su interacción por inmunoprecipitación (IP) e inmunofluorescencia (IFI), microscopía confocal (MC) y microscopía de fluorescencia por reflexión total interna (TIRFM). Para corroborar que Hsp70 esta involucrada en la regulación de Nox4, realizamos knockdown de la expresión de la chaperona utilizando un vector plasmídico conteniendo la secuencia de silenciamiento para Hsp72 y el vector vacío como control. Cultivos silenciados fueron tratados con AII y L como se indicó. La actividad de NAD(P)H-oxidasa se determinó por luminiscencia en extractos proteicos, y la producción de ROS por fluorescencia en células enteras. Resultados. Mientras que la estimulación con AII disminuyó la expresión de Caveolina 1 e incrementó la expresión de Nox4, el tratamiento con losartan incrementó la expresión de Caveolina 1 y Hsp70 y disminuyó los niveles de proteina Nox4 en fracción de membrana de PTCs SHR. La disminución de Hsp70 en SHR (L) vs SHR (AII) en fracción de citosol confirmó la translocación a membrana, observado por WB e IFI y MC. No se observaron diferencias en la expresión del ARN mensajero de Nox4 en los grupos estudiados. El incremento en la relación Hsp70/CHIP determinado por inmunoprecipitación contrastó con la disminución de Nox4 en fracción de membrana de SHR (L) vs SHR (AII). Observamos colocalización de Hsp70/CHIP/Nox4 por IFI, MC y TIRFM en membrana de SHR tratadas con losartan. El efecto del silenciamiento de Hsp72 se analizó por WB e IFI. El silenciamiento de Hsp72 se asoció con incremento en la expresión de Nox4, incremento en la actividad de NAD(P)H-oxidasa y producción de ROS en SHR (L+AII) relacionado con PTCs SHR (L+AII) no silenciadas; por lo que luego del silenciamiento, el tratamiento con losartan no pudo prevenir los efectos de AII en PTCs de SHR. Conclusión. Nuestros resultados permiten sugerir la participación activa de Hsp70 y CHIP en el mecanismo citoprotector de losartan mediante la regulación negativa de Nox4 en PTCs de SHR.