Rol del EPS de Xanthomonas axonopodis pv. citri en la cancrosis de los cítricos y en la respuesta no hospedadora

DUNGER, GERMÁN; RELLING, VERÓNICA; ORELLANO, ELENA G; OTTADO, JORGELINA

Buenos Aires

Congreso; Congreso Internacional Grupo Biotecnología; VI Simposio Nacional de Biotecnología; REDBIO Argentina 2005; Encuentro Trinacional REDBIO Argentina - Chile - Uruguay; 2005

REDBIO

Citrus es susceptible a gran variedad de fitopatógenos, siendo uno de los más agresivos Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Los síntomas comienzan con una lesión húmeda localizada, formándose luego ampollas circulares de 2 a 10 mm de diámetro y de coloración blanca o amarillenta con tendencia a oscurecer. La interacción de Xac con plantas no hospedadoras puede presentar una respuesta hipersensible (HR) caracterizada por la muerte celular rápida y restringida a la zona de ingreso del patógeno (Brunings & Gabriel, 2003). Al igual que el resto de las especies del género, Xac se caracteriza por la producción de xantano, un polisacárido extracelular (EPS) formado por polímeros de unidades pentasacárido. Se ha planteado anteriormente que, durante la patogénesis el xantano favorecería el humedecimiento de la zona afectada, reduciría el contacto de la bacteria con sustancias tóxicas producidas por el hospedador minimizando la interacción con la planta y promoviendo el establecimiento de la infección y consecuentemente la colonización de la planta. En la polimerización y secreción de xantano en Xanthomonas campestris pv. campestris están involucrados 12 genes denominados gum, desde gumB hasta gumM. El producto del gen gumD cataliza la transferencia de glucosa-1-fosfato en el primer paso del ensamblado de las unidades pentasacárido (Katzen et al., 1996).El objetivo de este trabajo es evaluar el rol del xantano en la interacción planta- patógeno para lo cual se construyó una Xac deficiente en la síntesis de xantano mediante deleción de la región que codifica para la transferasa del gen gumD.Se construyó una mutante de Xac en gumD, para lo cual se reemplazó el fragmento EcoRV-KpnI de gumD en el plásmido pUCgum por un casete de resistencia a los antibióticos espectinomicina y estreptomicina generando el plásmido pUCgum. Finalmente se construyó el plásmido movilizable pKmobgum a partir de pUCgum y el vector pKmobGII. Por conjugación bacteriana se transfirió el plásmido pKmobgum desde la cepa E. coli S17-1, a la Xac salvaje  obteniéndose las mutantes en el gen gumD, seleccionando las doble recombinantes por resistencia al antibiótico espectinomicina y sensibilidad a kanamicina. Se confirmó la mutación en gumD mediante Southern Blot cortando con las enzimas EcoRI y BamHI, y usando como sonda un producto de amplificación por PCR de 754 pb que hibrida en la zona central del gen Se infectaron hojas de plantas hospedadoras de naranja (Citrus sinensis cv. Petrópolis) y no hospedadoras de: algodón (Gossypium hirsutum), tomate (Lycopersicon esculetum) y tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Habana) con un inóculo inicial de 1x107 UFC/ml tanto de la cepa salvaje como de la mutante mediante infiltración con jeringa sin aguja.Se evaluó la muerte celular por la prueba bioquímica de azul de tripán y la emisión de peróxidos por el ensayo de diaminobencidina (DAB) en las zonas de la hoja infectadas por Xac salvaje y mutante.Se corroboró la presencia de la mutación en la cepa XacDgum mediante la técnica de Southern Blot, donde se observó una diferencia de tamaño entre los fragmentos de 1405 pb consecuencia de la inserción del casete de resistencia.Con el propósito de estudiar las diferencias entre las cepas salvajes y mutantes se realizaron plaqueos en medio SB-agar. De esta manera se observó diferencias en tamaño y consistencia, siendo la Xac salvaje la que presenta colonias más voluminosas y mucoides.Para caracterizar el rol de xantano en la interacción planta-patógeno, como ya ha sido estudiado con otras Xanthomonas (Katzen et al., 1996; Kemp et al., 2004; Rajeshwari & Sonti, 2000), se evaluó la respuesta  de XacDgum con plantas hospedadoras y no hospedadoras. El inicio de los síntomas se produjo al día 5 para ambas cepas de Xac no observándose diferencias en la infección promovidas por ambas bacterias.Los datos fenotípicos se acompañaron con curvas de crecimiento de las bacterias salvaje y mutante en la planta, no observándose diferencias de crecimiento entre cepas.Con el objetivo de evaluar la interacción con plantas no hospedadoras se realizaron infecciones en hojas de plantas de algodón, tomate y tabaco. Luego de 24 horas pudo observarse la formación de una zona necrótica en el lugar de infección, siendo idéntico en tiempo de aparición e intensidad en el tratamiento con la cepa salvaje y mutante. Estas apreciaciones se constataron mediante ensayo de azul de tripán y DAB, donde se pudo corroborar la necrosis y la emisión de peróxidos característica de la HR. Estos datos nos sugieren que el xantano no estaría involucrado en la interacción incompatible.Los resultados obtenidos sugieren que para realizar un ciclo infectivo sobre plantas hospedadoras de naranja, Xac no requeriría la presencia de xantano como se demuestra en este trabajo. En ausencia del mismo no modifica la patogenicidad ni el crecimiento en la planta. Además, se comprobó que el xantano no ejerce una barrera protectora contra productos antimicrobianos sintetizados durante la HR, ya que no se observó diferencia en las infecciones con las cepas salvaje y mutante de plantas no hospedadoras. Estos resultados indican que el xantano de Xac no tendría un rol indispensable en la interacción con la planta tanto compatible como incompatible.