Diseño de un ensayo in vitro para la evaluación del fitness de variantes virales del HBV. Aplicación al estudio de mutaciones asociadas al proceso de seroconversión del HBeAg durante la infección crónica.

SEVIC I; GONZÁLEZ LÓPEZ LEDESMA MM; FLICHMAN D; CAMPOS R

Congreso; XI Congreso Argentino De Virologia. II Congreso Latinoamericano de Virologia; 2015

El virus de hepatitis B (HBV) es un agente etiológico de enfermedad aguda y crónica con amplia distribución mundial. La infección crónica por HBV está asociada con patologías hepáticas severas como cirrosis y hepatocarcinoma. Durante el curso de la infección, el HBV evoluciona desde una etapa con elevada replicación viral, altos niveles de enzimas hepáticas y presencia del antígeno e (HBeAg) hacia una etapa de bajo nivel de replicación viral, enzimas hepáticas bajas/normales y presencia de anticuerpos antiHBe. La seroconversión de HBeAg a antiHBe está vinculada con la progresión de la patología hepática y puede detectarse a nivel molecular por la presencia de mutaciones en las regiones del promotor basal del core (BCP) y del precore (pC). La fijación de dichas mutaciones podría ser consecuencia de una ventaja comparativa por aumento de fitness que permitera el desplazamiento de la población viral salvaje, o bien, de una interacción diferencial de los virus mutados con el sistema inmune del hospedador. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema experimental que permitiera evaluar el fitness relativo del HBV a nivel celular. Se obtuvieron los clones de genoma completo de HBV: a. Mutante BCP con las mutaciones 1753C-1762T-1764A-1766T (BCPmut), b. Mutante pC 1896A (pCmut) o c. Cepa Salvaje sin estas mutaciones (HBVcs), 10-20 clones de por muestra. Se transfectaron células Huh7 con una relación 50%-50% de clones BCPmut o pCmut con HBVcs. El sobrenadante conteniendo la progenie viral fue cosechado a las 96 hs postransfección, el ADN viral fue extraído y amplificado por PCR. El producto de amplificación fue clonado y se analizó la frecuencia de cada variante en la progenie viral. Las frecuencias se compararon utilizando el test de Student. La frecuencia de clones BCPmut en la progenie (60,87±15,32%) fue significativamente mayor que la de HBVcs (39,13±15,32%) (p=0.045). Por otro lado, la diferencia en la frecuencia de clones entre clones pCmut (47,50±10,07%) y HBVcs (52,50±10,07%) no fue significativa (p=0,49). En conclusión, se desarrolló un ensayo que permite evaluar el fitness relativo del HBV. Esta herramienta permitirá caracterizar biológicamente las mutantes que emergen durante el curso de la infección crónica por HBV. Los resultados obtenidos sugieren que las BCPmut tienen una diferencia a nivel replicativo que implicaría una ventaja comparativa respecto de la cepa salvaje a nivel celular (mayor fitness). Mientras que la fijación de las mutaciones en el pC sería consecuencia de una ventaja de los virus mutados a nivel del individuo (igual fitness), lo que podría estar relacionado con su interacción con el sistema inmune del hospedador.