Evaluacion del fitness relativo del HBV mediante el metodo de cotransfeccion de genoma entero

SEVIC I; GONZÁLEZ LÓPEZ LEDESMA MM; FLICHMAN D; CAMPOS R

Simposio; XXXVI Reunion Cientifica Anual de la Sociedad Argentina de Virologia; 2016

El virus de hepatitis B (HBV) presenta una alta tasa de mutación y como consecuencia el virus circula como una población de variantes genéticas que evolucionan a lo largo de la infección. La evolución de la población viral, ya sea en la infección en un mismo paciente o en una población de individuos, muestra un complejo equilibrio que depende de factores tanto virales como del hospedador. Como resultado del proceso evolutivo, se establece aquella subpoblación viral (mutante a nivel intrahospedador o (sub)genotipo a nivel interhospedador) que presente el mayor fitness. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología que permita evaluar el fitness del HBV a nivel celular y utilizarla en el análisis de: a.- la evolución intrahospedador del HBV en la infección crónica (fijación de mutantes) y b.- la ocupación del nicho ecológico (prevalencia de (sub)genotipos).Para alcanzar el objetivo a, se obtuvieron los clones de genoma completo de HBV: sgtD1 salvaje (HBV-cs), mutante G1896A (HBV-mut) y mutante con deleción 1763-1770 (HBV-del). Se transfectaron células Huh7 con una relación 50%-50% de clones confrontando las combinaciones de la cepa salvajes y las cepas mutadas (HBV-cs vs HBV-mut; HBV-cs vs HBV-del y HBV-cs vs HBV-del). Se analizó la frecuencia de cada variante viral en el sobrenadante de cultivo. La frecuencia de clones HBV-del en la progenie fue significativamente menor que la de HBV-cs y HBV-mut, mientras que la diferencia entre las cepas HBV-cs y HBV-mut no fue significativa. Los resultados obtenidos sugieren que las HBV-cs y HBV-mut tienen una diferencia a nivel replicativo que implicaría unaventaja comparativa respecto de la cepa HBV-del a nivel celular, sin embargo existirán otros factores que podrían explicar la evolución de una población viral.Para alcanzar el objetivo b, se obtuvieron los clones de genoma completo de HBV: sgtF1b, sgtF4, sgtA2 y sgtD1. Se transfectaron células Huh7 con una relación 50%-50% de clones confrontando las combinaciones de los genotipos (F1b vs F4, F1b vs A2, F1b vs D1, F4 vs A2, F4 vs D1 y A2 vs D1). Se analizó la frecuencia de cada variante viral en el sobrenadante de cultivo. La diferencia en la frecuencia de clones entre los genotipos confrontados no fue significativa excepto la relación F1b-F4 que dio una diferencia significativa, siendo el sgtF1b el subgenotipo mayoritario en la progenie analizada. Los resultados de los ensayos a nivel celular muestran que el F1b predominaría por sobre F4 lo que podría explicar, al menos en parte, la ocupación del nicho ecológico de las nuevas infecciones por el F1b.En conclusión, se desarrolló un ensayo que facilitará el análisis de las interacciones entre las variantes virales y ayudará evaluar el fitness relativo del HBV in vitro. Esta herramienta contribuirá al entendimiento de los mecanismos de la selección durante el curso de la infección crónica por HBV.