Diseño y optimización de un ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real para genes de virulencia que codifican para toxinas tipo shiga 1 2 (Stx1 y Stx2) en cepas enterohemorrágicas de Escherichia coli

GARRAZA, ROMINA; SALINAS, GABRIEL; JURI AYUB MAXIMILIANO; MANZUR MARÍA JIMENA

San Luis

Jornada; IV Jornadas de Bioquimicas y II Jornada de Tecnicos; 2022

Ministerio de Salud de la Provincia de San Luis

Diseño y optimización de un ensayo de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real para genes de virulencia que codifican para toxinas tipo shiga 1 2 (Stx1 y Stx2) en cepas enterohemorrágicas de Escherichia coliGARRAZA Romina1, SALINAS Angel Gabriel2, JURI AYUB Maximiliano1, MANZUR Jimena1 (*) 1 Laboratorio de Desarrollo de Diagnósticos Moleculares, Área Biología Molecular. 2 Área de Microbiología e Inmunología. FQByF. Universidad Nacional de San Luis.(*) Contacto: jimemanzur80@gmail.com Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno frecuentemente asociado a Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETAs). El potencial de las cepas STEC para causar enfermedad está directamente relacionada con su capacidad para secretar toxinas Shiga tipo 1 y tipo 2 (Stx1, Stx2). Por lo tanto, los ensayos de detección de Stx se consideran los métodos más adecuados para el diagnóstico oportuno y preciso de las infecciones por STEC. Las principales fuentes de contaminación humana suelen provenir de la ingesta de agua o alimentos contaminados. Los alimentos más comúnmente implicados en brotes han sido los productos de origen bovino, por lo que las estrategias para evitar su transmisión deberían concentrarse fundamentalmente en la planta de faena. En nuestro laboratorio hemos adaptado y optimizado un protocolo de referencia (https://doi.org/10.1016/j.mcp.2003.12.004) para la detección y tipificación simultánea de los genes Stx1, Stx2 y Ribonucleasa P (RNAsa P) bovina mediante PCR cuantitativa (qPCR) múltiplex. Para ello realizamos búsquedas por homología en bases de datos genómicas de los genes que codifican para las toxinas STX1 y STX2. El alineamiento múltiple de secuencias nos permitió identificar regiones específicas, sobre las cuales se diseñaron oligonucleótidos para la detección de cada una. Asimismo, diseñamos una reacción control, utilizando como diana al gen que codifica para RNAsa P bovina. De esta manera, en ensayos de detección sobre alimentos de origen vacuno, su amplificación nos permite evitar falsos negativos. Por último, optimizamos las condiciones de reacción mediante curvas de concentración de oligonucleótidos y sondas, identificando las mejores condiciones para la amplificación simultánea de las tres dianas. La validación del método se realizó mediante la amplificación de ADN genómico proveniente de tres cepas de referencia de STECs (O157:H7 stx1+/stx2+; O26 stx1+ y O145 stx2+) provenientes del Servicio de Fisiopatogenia del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI-ANLIS, “Dr. Carlos G. Malbrán”). El ensayo diseñado y optimizado en este trabajo podría ser empleado de manera rápida y eficiente para la detección y tipificación de infecciones por STEC en alimentos de origen vacuno.