Puesta a punto de una técnica de identificación de ADN de Plasmodium por PCR a partir de muestras de sangre en papel de filtro

SILVA, J.L.; LUCERO, R.H.; FORMICHELLI, L.; RAMIREZ P.G.; STEIN M

Bahia Blanca

Congreso; VI Congreso Argentino de Parasitología; 2012

Asociación Parasitológica Argentina

Dada la necesidad de diagnosticar rápidamente la malaria para un óptimo tratamiento, resulta conveniente realizar una técnica que ofrezca una alternativa práctica a las utilizadas hoy día en nuestro país, como la aplicación de PCR. Se puso a punto una técnica de identificación de ADN de Plasmodium mediante PCR a partir de muestras de sangre en papel de filtro. Se desarrolló una técnica de extracción de ADN original que consistió en cortar secciones circulares de los papeles de filtro, colocarlos en tubos Eppendorf y añadir 700 l de solución de homogeneización con CTAB al 2%, se incubó por una hora a 56ºC, se añadieron 700 l de cloroformo-alcohol isoamílico y centrifugó tres veces a 5000 rpm/5 minutos recuperando el sobrenadante; se agregaron 700 l de alcohol isopropílico centrifugando a 13000 rpm/ 15 minutos descartando el sobrenadante, se lavó el pellet con un volumen de etanol 70%, centrifugando a 13000 rpm/ 5 minutos, se secó y resuspendió el ADN con l de agua destilada estéril. Se colocó 10 l de cada muestra de ADN con una solución madre con agua destilada estéril, buffer1X, MgCl2 1,5 mmol/l, dNTPs 0,5 mol/l, 0,5 mol/l de cada primer UNR y PLF (amplifican una secuencia del gen de la subunidad pequeña ribosomal 18S de Plasmodium), 0,075 U/l de DNA polimerasa Taq. Se programaron en un termociclador los ciclos: 5 minutos a 94ºC, 40 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, y 90 segundos a 72ºC. Por electroforesis en gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de etidio se visualizaron bandas de 700 a 800 pb correspondientes al ADN de Plasmodium spp. Estos resultados aún no han sido comparados con otras técnicas.