Obtención de una línea de células de insecto Sf9 que expresa constitutivamente la glicoproteína del virus rábico.

GARANZINI D P, DEL MÉDICO ZAJAC M P, PERALTA A, CALAMENTE G; PÉREZ O R

CABA

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

La rabia es una enfermedad zoonótica de evolución aguda,habitualmente mortal. Su agente causal, el virus de la rabia (RV), ha sidoampliamente estudiado y caracterizado. La glicoproteína (RG) es la únicaproteína viral expuesta y principal antígeno capaz de inducir protecciónfrente al desafío con RV. En nuestro laboratorio se desarrollan vacunasbiotecnológicas contra RV que poseen a la glicoproteína como componente principal. La potencia de las vacunas antirrábicas obtenidasse evalúa mediante las pruebas recomendadas por SENASA en el modelomurino de desafío intracerebral. Una vez confirmada la protección frenteal desafío, es necesario caracterizar el perfil de respuesta inmune(humoral y celular) inducido por los nuevos candidatos vacunales, paralo cual es fundamental disponer de herramientas moleculares quepermitan su evaluación en el laboratorio.El objetivo de este trabajo fue la obtención de una línea celular Sf9 queexprese constitutivamente la proteína RG como herramienta molecularpara la evaluación de la respuesta inmune humoral y celular específicamediante ELISA y linfoproliferación, respectivamente. La secuenciacodificante de RG se amplificó por PCR utilizando como templado unaconstrucción plasmídica disponible en el laboratorio y oligonucleótidosespecíficos. El amplicon obtenido se clonó en el vector pGEMT-Easy y laidentidad del inserto se confirmó mediante secuenciación.Posteriormente, la secuencia de interés se subclonó de maneradireccional en el vector pIB/V5-His. Este vector posee un gen deresistencia a blasticidina (para la selección de las células establementetransfectadas), el promotor OpIE2 (para la expresión constitutiva del gende interés en células de insecto) y, por la estrategia de clonado, permiteobtener la proteína de interés fusionada a un tracto de seis histidinas enel extremo C-terminal (para su purificación mediante columnas deafinidad). El vector pIB-V5His-RG se transfectó en células Sf9 utilizandoel lípido catiónico Cellfectin® y se adicionó blasticidina (80 μg/ml) para laselección de las células establemente transfectadas. Se realizaronpasajes sucesivos de los clones resistentes a blasticidina, disminuyendopaulatinamente la concentración del antibiótico (hasta unaconcentración de 10 μg/ml). Posteriormente, la presencia y expresión dela secuencia codificante de RG se confirmó mediante amplificación porPCR y Western blot, respectivamente. Finalmente, mediante un ensayode dot-blot se determinó que los sueros antirrábicos positivos soloreaccionan con los extractos celulares de la línea Sf9-RG mientras no seobservó señal específica frente a extractos de células Sf9 notransfectadas.En este trabajo se obtuvo una línea celular Sf9 que expresaconstitutivamente la proteína RG que es reconocida específicamente porsueros antirrábicos. La línea Sf9-RG se utilizará para la evaluación delperfil de respuesta inmune inducida por los nuevos candidatos a vacunasantirrábicas