Construcción de vectores de transferencia para la obtención de poxvirus recombinantes que expresan antígenos del virus respiratorio sincicial bovino.

FERELLA, A.; DEL MÉDICO ZAJAC, M.P.; DUS SANTOS, M.J.; MOZGOVOJ, M. Y CALAMANTE, G.

CABA

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2013

Sociedad Argentina de Virología.

Los virus canarypox (CNPV) y vaccinia Ankara modificado (MVA) se utilizan como vectores para el desarrollo de vacunas seguras y efectivas contra enfermedades infecciosas. Teniendo en cuenta la efectividad de las vacunas basadas en poxvirus y que el virus respiratorio sincicial bovino (bRSV) es una de las principales causas de enfermedad respiratoria en bovinos jóvenes generando importantes pérdidas económicas a nivel productivo, nos propusimos obtener nuevas vacunas contra este agente infeccioso. Nuestra línea de investigación esta dirigida a la obtención de CNPV recombinantes que expresen simultáneamente las proteínas F y G de bRSV y MVA recombinantes que expresen estas proteínas individualmente desde el background genético de un vector de MVA que posee delecionado el gen codificante para la proteína de unión a IL-18 (MVAd008). Se seleccionaron las proteínas G y F por ser inductoras de inmunidad protectora. El gran tamaño del genoma de los poxvirus descarta la manipulación directa del ADN y los poxvirus recombinantes se obtienen por recombinación homóloga entre el genoma del virus y un vector de transferencia (VT) que porta el gen de interés flanqueado por regiones genómicas que serán el blanco de inserción. El objetivo de este trabajo fue la construcción de las herramientas moleculares que permitan la obtención de MVAd008 y CNPV recombinantes que expresan antígenos de bRSV. La secuencia codificante de la proteína G se clonó en los VT-134lacZ que permitirá obtener CNPV recombinantes por inserción en la región intergénica entre CNPV134 y CNPV135. En el caso de MVA las secuencias codificantes de las proteínas G y F se clonaron en el VT-MTK-GUS que permitirá la recombinación homóloga con la secuencia genómica viral correspondiente al gen MVA086R. En todos los casos, la expresión del gen foráneo está dirigida por el promotor temprano poxviral pEL. Además, los vectores de transferencia portan un cassette para la expresión de enzimas marcadoras [beta-galactosidasa (betaGal) o beta-glucuronidasa (GUS)]. Los genes de interés se obtuvieron por amplificación por PCR y se clonaron direccionalmente en los VT correspondientes mediante la inclusión de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en los oligonucleótidos iniciadores. El VT-134-G y los VT-MTK-F o VT-MTK-G se transfectaron en cultivos de fibroblastos de embrión de pollo infectados con CNPV o MVAd008, respectivamente. El aislamiento de los virus recombinantes se realiza por su capacidad de formar placas de lisis azules en presencia de Bluo-gal o X-Gluc, sustratos de las enzimas marcadoras betaGal y GUS. En este trabajo se construyeron los VT que portan las secuencias codificantes de las proteínas inmunogénicas F o G de bRSV y se comenzó el proceso de aislamientos de los poxvirus recombinantes respectivos.