Vectores de MVA optimizados que expresan antígenos foráneos: su obtención y caracterización

DEL MEDICO ZAJAC, M. P.; RODRIGUEZ, A. M.; FALIVENE, J.; GHERARDI, M. M. Y CALAMANTE, G.

CABA

Congreso; X Congreso Argentino de Virologia; 2011

Sociedad Argentina de Virologia

El virus vaccinia Ankara modificado (MVA) es una cepa altamente atenuada que se evalúa en ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer, malaria, tuberculosis y sida. Actualmente, existe interés en obtener una nueva generación de vectores de MVA que sean mejores inmunógenos. Una de las estrategias utilizadas consiste en delecionar genes que codifican proteínas capaces de contrarrestar o limitar la respuesta inmune del hospedador esperando inducir una respuesta inmune más eficaz contra el antígeno de interés. Previamente, en nuestro laboratorio, se obtuvo el virus MVAd008 que posee la deleción del gen 008L (homólogo al gen C12L del virus vaccinia) que codifica para la proteína de unión a interleuquina 18 (IL-18bp). Este virus se evaluó en ratones y se determinó que la expresión de IL-18bp contribuye a la evasión de la respuesta inmune y que su deleción del genoma viral produce un aumento de la respuesta específica contra diferentes epitopes del vector, que se correlacionó con una mayor protección frente al desafío intranasal con la cepa WR del virus vaccinia que la obtenida con MVA wt. En este contexto es importante evaluar la capacidad inmunogénica de MVAd008 frente a antígenos heterólogos. El objetivo de este trabajo es obtener y caracterizar molecularmente los MVAd008 que porten las secuencias codificantes del antígeno 85A de Mycobacterium bovis o de la proteína nef de HIV B/F. Para ello, la secuencia codificante de Ag 85A se amplificó por PCR y se clonó en el vector de transferencia VT-MTK-GUS. El vector VT-MTK-GUS-85A se transfectó en fibroblastos de embrión de pollo (FEP) previamente infectados con MVA wt o MVAd008. La selección de los virus recombinantes se realizó por clonado de las partículas infectivas bajo agar y análisis de la expresión del gen marcador (capacidad de formar placas de lisis azules en presencia del sustrato X-gluc). Se obtuvieron los virus recombinantes MVA-85A y MVAd008-85A. De manera similar pero utilizando el vector pJR101-nefBF se transfectaron FEP infectados con MVAd008 y se aislaron los virus recombinantes MVAd008-nef. Los virus recombinantes obtenidos fueron caracterizados molecularmente y se detectó la presencia y expresión de los genes foráneos mediante las técnicas de PCR y Western blot, respectivamente. Además, mediante PCR se determinó la pureza del stock viral recombinante y la presencia/ausencia del gen 008L. Se logró implementar la metodología de selección de virus doble recombinantes ya que los virus MVAd008 poseen un reemplazo alélico 008L/lac Z y la inserción del gen de interés se realizó en otro gen viral (codificante de timidina quinasa o hemaglutinina) mediante la selección con el gen marcador que codifica para la enzima GUS. Se obtuvieron los virus recombinantes MVA-85A, MVAd008-85A y MVA-d008-nef que expresan in vitro las proteínas foráneas de interés. Estos virus serán utilizados para evaluar y comparar la respuesta inmune generada por los vectores convencionales y optimizados en ensayos in vitro (con un antígeno modelo como nef) o en pruebas de desafío con M. bovis en el modelo ratón.